目的:糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)是一種嚴(yán)重的糖尿病微血管并發(fā)癥,也是引起終末期腎病的首要原因。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-146b可能是急性腎損傷早期診斷及預(yù)后標(biāo)志物,在此我們進(jìn)一步探究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes,hucMSC-Ex)延緩DKD中miR-146b的作用機(jī)制,為hucMSC-Ex的臨床應(yīng)用提供新的實驗依據(jù)。方法:以高脂飲食及鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)構(gòu)建DKD大鼠模型,正常SD大鼠(Normal組)為對照,取造模后8、16、24周腎組織,通過HE染色及Masson染色驗證DKD模型構(gòu)建成功;體外高糖環(huán)境下培養(yǎng)三種腎細(xì)胞,即大鼠腎小球系膜細(xì)胞(HBZY-1)、大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)和大鼠足細(xì)胞(podocyte);提取大鼠腎組織及體外培養(yǎng)的腎細(xì)胞RNA檢測miR-146b表達(dá)量。通過大量文獻(xiàn)閱讀及TargetScan軟件預(yù)測miR-146b靶基因為NF2(2型神經(jīng)纖維瘤),編碼Merlin蛋白,雙熒光...

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略詞中英文注釋表
第一章 緒論
    1.1 間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體
        1.1.1 外泌體的生物學(xué)特性
        1.1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞概述及應(yīng)用
        1.1.3 人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體在疾病中的應(yīng)用
    1.2 糖尿病腎病
        1.2.1 糖尿病腎病概述
        1.2.2 糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制
        1.2.3 糖尿病腎病與干細(xì)胞治療
    1.3 microRNAs與糖尿病腎病
        1.3.1 microRNAs概述
        1.3.2 microRNA與糖尿病腎病
        1.3.3 miR-146b的研究現(xiàn)狀
第二章 研究目的、方法、實驗方案及意義
    2.1 研究目的
    2.2 研究方法
    2.3 實驗設(shè)計方案
        2.3.1 技術(shù)路線1
        2.3.2 技術(shù)路線2
        2.3.3 技術(shù)路線3
        2.3.4 技術(shù)路線4
    2.4 研究意義
第三章 miR-146b在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的作用研究
    3.1 實驗材料與儀器
        3.1.1 主要材料及試劑
        3.1.2 主要儀器及耗材
    3.2 方法
        3.2.1 糖尿病腎病大鼠模型構(gòu)建
        3.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與體外模型構(gòu)建
        3.2.3 HE染色
        3.2.4 Masson染色
        3.2.5 總RNA提取
        3.2.6 microRNA逆轉(zhuǎn)錄
        3.2.7 qRT-PCR
        3.2.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 糖尿病腎病大鼠顯示腎小球間質(zhì)纖維化
        3.3.2 糖尿病腎病大鼠腎組織miR-146b表達(dá)升高
        3.3.3 高糖環(huán)境下miR-146b在 HBZY-1 表達(dá)升高
    3.4 討論
第四章 miR-146b參與糖尿病腎病的作用機(jī)制研究
    4.1 實驗材料與儀器
        4.1.1 主要材料、試劑
        4.1.2 主要儀器
    4.2 方法
        4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
        4.2.2雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?br>        4.2.3 細(xì)胞蛋白提取
        4.2.4 Western Blot
        4.2.5 細(xì)胞RNA提取
        4.2.6 逆轉(zhuǎn)錄
        4.2.7 qRT-PCR
        4.2.8 免疫熒光
        4.2.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 Merlin為 miR-146b的靶基因
        4.3.2 HBZY-1 轉(zhuǎn)染miR-146b后驗證下游通路
        4.3.3 HBZY-1 轉(zhuǎn)染mi R-146b后Merlin/YAP細(xì)胞內(nèi)定位
    4.4 討論
第五章 hucMSC-Ex對糖尿病腎病的損傷修復(fù)作用研究
    5.1 實驗材料與儀器
        5.1.1 主要材料、試劑
        5.1.2 主要儀器
    5.2 方法
        5.2.1 huc MSC-Ex提取及鑒定
        5.2.2 huc MSC-Ex修復(fù)體內(nèi)模型構(gòu)建
        5.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及處理
        5.2.4 免疫組織化學(xué)染色
        5.2.5 組織蛋白提取
        5.2.6 Western Blot
        5.2.7 q RT-PCR
        5.2.8 免疫熒光
        5.2.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 huc MSC-Ex的鑒定
        5.3.2 huc MSC-Ex下調(diào)mi R-146b,促進(jìn)Merlin表達(dá)減輕DKD腎損傷
        5.3.3 huc MSC-Ex體外抑制mi R-146b,上調(diào)Merlin改善腎細(xì)胞損傷
        5.3.4 免疫熒光檢測Merlin/YAP細(xì)胞內(nèi)定位
    5.4 討論
第六章 hucMSC-Ex調(diào)控mi R-146b修復(fù)延緩糖尿病腎病的作用機(jī)制
    6.1 實驗材料與儀器
        6.1.1 主要材料、試劑
        6.1.2 主要儀器、耗材
    6.2 方法
        6.2.1 huc MSC-Ex總RNA提取
        6.2.2 circ RNA逆轉(zhuǎn)錄與q RT-PCR
        6.2.3 細(xì)胞模型及si RNA轉(zhuǎn)染
        6.2.4 細(xì)胞總RNA提取及q RT-PCR
        6.2.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?br>        6.2.6 Western Blot
        6.2.7 免疫熒光
        6.2.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計
    6.3 結(jié)果
        6.3.1 huc MSC-Ex中篩選hsa_circ₀002940 為mi R-146b上游分子
        6.3.2 hsa_circ₀002940 靶向作用于mi R-146b
        6.3.3 hsa_circ₀002940 在細(xì)胞模型中huc MSC-Ex組表達(dá)升高
        6.3.4 hsa_circ₀002940 敲減后抑制huc MSC-Ex的功能
        6.3.5 hsa_circ₀002940 敲減后Merlin/YAP細(xì)胞內(nèi)定位
    6.4 討論
第七章 結(jié)論與展望
    1. 結(jié)論
    2. 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與參加的會議



本文編號：3971577