目的構(gòu)建人磷脂酰肌醇4-磷酸酶Ⅱ型(inositol polyphosphate 4-phosphatase typeⅡ,INPP4B)重組慢病毒表達載體,并檢測其在人雄激素抵抗型前列腺癌細胞株P(guān)C3中的表達。方法以人工合成的人INPP4B基因為模板,PCR擴增目的基因片段,克隆入pGC-FU載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pGC-FU-INPP4B,將其與輔助包裝原件PHelper 1. 0和PHelper 2. 0載體經(jīng)Lipofectamine TM 2000介導共轉(zhuǎn)染293T細胞,包裝獲得攜帶人INPP4B基因的重組慢病毒LentiINPP4B,免疫熒光法測定病毒滴度。用Lenti-INPP4B感染PC3細胞(Lenti-INPP4B組),以慢病毒Lenti-GFP(攜帶GFP基因)感染的PC3細胞為陰性對照,RT-PCR及Western blot檢測PC3細胞中INPP4B m RNA水平和蛋白的表達,CCK8法檢測PC3細胞增殖;Western blot檢測PC3細胞中p-AKT水平。結(jié)果經(jīng)PCR及測序鑒定,重組質(zhì)粒p GC-FU-INPP4B構(gòu)建正確;Lenti-INPP4B病毒滴度達2...

【文章頁數(shù)】：5 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 細胞、載體、病毒及基因
    1.2 主要試劑
    1.3 人INPP4B基因的擴增
    1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
    1.5 慢病毒Lenti-INPP4B的包裝重組及病毒滴度測定
    1.6 Lenti-INPP4B感染PC3細胞
    1.7 PC3細胞中INPP4B基因m RNA水平的檢測
    1.8 PC3細胞中INPP4B蛋白表達的檢測
    1.9 INPP4B表達對PC3細胞活力影響的檢測
    1.1 0 INPP4B表達對PC3細胞內(nèi)p-AKT水平影響的檢測
    1.1 1 統(tǒng)計學分析
2 結(jié)果
    2.1 INPP4B目的基因擴增產(chǎn)物的鑒定
    2.2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定
    2.3 Lenti-INPP4B的病毒滴度
    2.4 Lenti-INPP4B病毒感染率
    2.5 PC3細胞中INPP4B基因m RNA水平
    2.6 PC3細胞中INPP4B蛋白表達
    2.7 INPP4B表達對PC3細胞活力的影響
    2.8 INPP4B表達對PC3細胞內(nèi)p-AKT水平的影響
3 討論



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