本文關(guān)鍵詞：尿毒癥血清對阿托伐他訂在Caco-2細胞模型中轉(zhuǎn)運的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的慢性腎臟病(Chronic kidney Disease,CKD)可以影響主要經(jīng)腎臟排泄的藥物的清除,慢性腎臟病患者在應用此類藥物時,需調(diào)整劑量。但是CKD對主要經(jīng)過肝臟代謝或膽汁排泄的藥物的體內(nèi)過程的影響研究很少。研究表明,CKD患者體內(nèi)蓄積的尿毒癥毒素,在加速腎功能惡化,損害細胞和基質(zhì)蛋白的同時,還可以改變藥物的體內(nèi)過程。研究已經(jīng)證明,尿毒癥血清可以影響腸道轉(zhuǎn)運體的mRNA和蛋白的表達,但是目前尚無尿毒癥血清對藥物經(jīng)腸道轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運影響的研究。阿托伐他汀(Atorvastatin, ATV)是慢性腎臟病患者常使用的藥物之一,在體內(nèi)主要經(jīng)肝臟代謝、膽汁排泄,僅2%經(jīng)腎臟排泄。研究表明,在腸道轉(zhuǎn)運模型-Caco-2細胞模型中單羧酸轉(zhuǎn)運體-1 (Monocarboxylate transporter, MCT1)和P-糖蛋白(P-glycorprotein,P-gp)轉(zhuǎn)運體介導阿托伐他汀的吸收和外排。因此本課題利用Caco-2細胞模型,考察尿毒癥血清對阿托伐他汀在小腸上皮細胞中轉(zhuǎn)運的影響,對MCT1介導阿托伐他汀吸收的影響和對P-gp介導阿托伐他汀外排的影響,探討阿托伐他汀在慢性腎衰竭患者腸道的吸收情況,為其臨床應用提供更多的理論依據(jù)。方法1.Caco-2細胞模型的建立和驗證將對數(shù)生長期的Caco-2細胞接種到Transwell 24孔板上培養(yǎng)21天,建立Caco-2單細胞層模型,以P-糖蛋白的陽性底物地高辛為探針藥物,并通過測定地高辛的表觀通透系數(shù)驗證模型建立成功,同時利用電子顯微鏡掃描Caco-2細胞單層來觀察細胞形態(tài)學,并利用電阻儀測定單層膜的跨膜電阻值,考察Caco-2單細胞層模型的致密性和完整性。2.驗證ATV在Caco-2細胞模型中的轉(zhuǎn)運情況采用Caco-2單細胞層模型,通過測定阿托伐他汀自膜的基底面(Basolateral side,BL)側(cè)向絨毛面(Apical side,AP)側(cè)及AP側(cè)向BL側(cè)轉(zhuǎn)運時的表觀通透系 數(shù)(apparent permeability,Papp)并計算其外排系數(shù)Papp(BL→AP)/Papp(AP→BL),考察阿托伐他汀在Caco-2單細胞層模型中的轉(zhuǎn)運情況。1.尿毒癥血清對ATV在Caco-2細胞模型中經(jīng)P-gp外排時的影響采用Caco-2單細胞層模型,以空白血清為對照,通過比較在40、80、120min時,尿毒癥血清組與空白血清組及P-gp抑制劑GG918組的表觀滲透系數(shù),考察尿毒癥血清對ATV經(jīng)P-gp外排的影響。2.尿毒癥血清對阿托伐他汀在Caco-2細胞模型中經(jīng)MCT1吸收時的影響采用Caco-2單細胞層模型,以空白血清為對照,通過比較在40、80.120min時,尿毒癥血清組與空白血清組及MCT1抑制劑苯甲酸組的表觀滲透系數(shù),考察尿毒癥血清對ATV經(jīng)MCT1吸收的影響。結(jié)果1.Caco-2細胞模型的建立經(jīng)過21天的培養(yǎng)周期,Caco-2細胞分化完全、形成緊密連接。選擇通過細胞位儀測定的跨膜電阻值TEER大于400Ω·cm2的單層膜用于轉(zhuǎn)運試驗；隨著時間的增長,地高辛的跨膜轉(zhuǎn)運量逐漸增加,且120min時地高辛的表觀滲透系數(shù)Papp(BL→AP)為11.3±0.7×106cm.s-1, Papp(AP→BL)為3.41±1.4×106cm.s-1,外排系數(shù)Papp(BL→AP)/Papp(AP→BL)為3.31,表明其外排方向(BL→AP)占轉(zhuǎn)運的主導地位,與文獻報道相符,說明Caco-2細胞模型中P-gp表達水平高,該模型可用于轉(zhuǎn)運試驗。2.ATV在Caco-2細胞模型中的轉(zhuǎn)運考察在符合條件的Caco-2細胞單層膜中,隨著時間的增長,ATV的跨膜轉(zhuǎn)運量逐漸增加,在80、120min時ATV的表觀滲透系數(shù)Papp(BL→AP)和Papp(AP→BL)存在顯著性差異,且120min時Papp(BL→AP)為39.5±9.4×106cm.s-1, Papp(AP→BL)為2.55±0.8×106cm.s-1,外排系數(shù)Papp(BL→AP).Papp(AP→BL)為15.4,表明其外排方向(BL→AP)占轉(zhuǎn)運的主導地位,與文獻中ATV的表觀滲透系數(shù)值接近。3.尿毒癥血清對ATV在Caco-2細胞模型中經(jīng)P-gp外排時的影響ATV在空白血清、尿毒癥血清及P-gp抑制劑GG918的抑制劑組中經(jīng)P-gp外排時,在120min內(nèi),P-gp的抑制劑GG918和尿毒癥血清抑制ATV的外排,與正常血清組相比,上述兩組ATV的Papp(BL→AP)值均降低,并且在80min和120min時,尿毒癥血清ATV的Papp(BL→AP)顯著降低(p0.01,p0.05)；另外,與抑制劑組相比,40、80、120min時尿毒癥血清組ATV的Papp(BL→AP)均降低,且在120min存在顯著性差異(p0.05)。4.尿毒癥血清對ATV在Caco-2細胞模型中經(jīng)MCT1吸收時的影響ATV在空白血清、尿毒癥血清及MCT1抑制劑苯甲酸的抑制劑組中經(jīng)MCT1吸收時,在120min內(nèi),與正常血清組相比,加入競爭性抑制ATV經(jīng)MCT1吸收的苯甲酸抑制劑組ATV的Papp(AP→BL)值降低,說明抑制劑苯甲酸抑制ATV的吸收。同時,與正常血清組相比,尿毒癥血清也抑制其吸收,在40、80、120min時,該組ATV的Papp(AP→BL)顯著降低(p0.05、p0.05、p0.01)；并且尿毒癥血清組Papp(AP→BL)值均小于抑制劑組,且在120min時存在顯著性差異(p0.05)。結(jié)論1.本實驗通過將對數(shù)生長期的Caco-2細胞接種到Transwell 24L板上,經(jīng)過21天的培養(yǎng)周期,以P-糖蛋白的陽性底物地高辛為探針藥物,通過測定地高辛的表觀通透系數(shù)驗證模型建立成功,同時利用電子顯微鏡掃描Caco-2單細胞層觀察Caco-2細胞分化完全、形成緊密連接,選擇單層膜電阻)400Ω·cm2的單層膜用于轉(zhuǎn)運實驗。本實驗中地高辛和待測化合物ATV在Caco-2單細胞層模型中的表觀滲透系數(shù)Papp(BL→AP)值及Papp(AP→BL)值和文獻中報道中的數(shù)據(jù)接近,說明本實驗建立的Caco-2單細胞層模型穩(wěn)定可靠。2.在Caco-2細胞模型中,尿毒癥血清對ATV經(jīng)P-gp外排和經(jīng)MCT1吸收的過程均具有抑制作用。提示：慢性腎功能衰竭患者的血清中可能含有可以抑制分別介導ATV外排和吸收的P-gp和MCT1活性的因子,從而影響ATV在腸道的吸收過程。此外,根據(jù)本實驗研究結(jié)果推測,尿毒癥血清可能同時影響腸道上皮細胞中介導阿托伐他汀吸收和外排的其他轉(zhuǎn)運體及介導其代謝的CYP3A代謝酶的功能和活性,需要進行更深入的研究,更全面的考察尿毒癥血清對ATV在腸道及其他器官的轉(zhuǎn)運和代謝的影響,為臨床終末期腎臟病患者應用ATV時提供更多的實驗依據(jù),以確保其用藥的安全性和有效性。
【關(guān)鍵詞】：尿毒癥血清 阿托伐他汀 Caco-2單細胞層 P-糖蛋白 單羧酸轉(zhuǎn)運體-1 轉(zhuǎn)運
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R692.5
【目錄】：

• 中文摘要8-12
• ABSTRACT12-16
• 符號說明16-17
• 前言17-22
• 第一部分 Caco-2細胞模型的建立和驗證22-32
• 1 實驗材料22-23
• 1.1 主要儀器22
• 1.2 主要試劑22
• 1.3 細胞22-23
• 2 實驗方法23-27
• 2.1 Caco-2細胞培養(yǎng)23-24
• 2.1.1 細胞培養(yǎng)23
• 2.1.2 細胞凍存23
• 2.1.3 細胞復蘇23-24
• 2.2 Caco-2單細胞層模型的建立24
• 2.3 Caco-2單細胞層模型的驗證24-27
• 2.3.1 地高辛在Caco-2細胞模型中的轉(zhuǎn)運24-27
• 2.3.1.1 藥物溶液的配制24
• 2.3.1.2 地高辛的雙向轉(zhuǎn)運實驗24-25
• 2.3.1.3 地高辛的測定方法的建立25
• 2.3.1.4 地高辛標準曲線的制備25-26
• 2.3.1.5 樣品處理26
• 2.3.1.6 轉(zhuǎn)運實驗的評價指標26
• 2.3.1.7 統(tǒng)計學分析26-27
• 2.3.2 Caco-2單細胞層的電鏡掃描驗證27
• 3 結(jié)果27-29
• 3.1 地高辛在Caco-2細胞模型中的雙向轉(zhuǎn)運實驗27-28
• 3.2 電子顯微鏡鏡掃描Caco-2細胞單細胞層的結(jié)果28-29
• 4 討論29-31
• 4.1 Caco-2細胞模型的建立29-30
• 4.2 模型驗證陽性藥物的選擇30
• 4.3 Caco-2細胞模型的局限性30-31
• 5 結(jié)論31-32
• 第二部分 阿托伐他汀在Caco-2細胞中的轉(zhuǎn)運32-38
• 1 實驗材料32-33
• 1.1 主要儀器32
• 1.2 主要試劑32-33
• 2 實驗方法33-35
• 2.1 阿托伐他汀在Caco-2細胞中的轉(zhuǎn)運實驗33-34
• 2.1.1 藥物溶液的配制33
• 2.1.2 阿托伐他汀在Caco-2細胞模型中的雙向轉(zhuǎn)運實驗33-34
• 2.2 阿托伐他汀的測定方法的建立34
• 2.3 阿托伐他汀標準曲線的制備34-35
• 2.4 樣品處理35
• 2.5 轉(zhuǎn)運實驗的評價指標35
• 2.6 統(tǒng)計學分析35
• 3 結(jié)果35-37
• 3.1 阿托伐他汀的雙向轉(zhuǎn)運實驗35-37
• 4 討論37-38
• 第三部分 尿毒癥血清對阿托伐他汀在Caco-2細胞中轉(zhuǎn)運的影響38-53
• 1 實驗材料38-39
• 1.1 主要儀器38
• 1.2 主要試劑38-39
• 1.3 血清39
• 2 實驗方法39-44
• 2.1 尿毒癥血清對ATV在Caco-2細胞模型中轉(zhuǎn)運的影響39-44
• 2.1.1 藥物溶液的配制39-41
• 2.1.2 尿毒癥血清對ATV經(jīng)P-gp外排時影響的轉(zhuǎn)運實驗41
• 2.1.3 尿毒癥血清對ATV經(jīng)MCT1吸收時影響的轉(zhuǎn)運實驗41-42
• 2.1.4 阿托伐他汀標準曲線的制備42-43
• 2.1.4.1 在含10%CKD血清+GG918中的ATV的標準曲線的制備42
• 2.1.4.2 在含10%正常血清中的ATV的標準曲線的制備42-43
• 2.1.5 阿托伐他汀的樣品測定43
• 2.1.6 樣品處理43
• 2.1.7 轉(zhuǎn)運實驗的評價指標43
• 2.1.8 統(tǒng)計學分析43-44
• 3 結(jié)果44-46
• 3.1 尿毒癥血清對ATV經(jīng)P-gp外排時的影響44-45
• 3.2 尿毒癥血清對ATV經(jīng)MCT1吸收時的影響45-46
• 4 討論46-52
• 4.1 尿毒癥血清對轉(zhuǎn)運體P-gp和MCT1的影響46-50
• 4.2 實驗的局限性50-52
• 4.2.1 尿毒癥血清對腸道中其他藥物轉(zhuǎn)運體的影響50-51
• 4.2.2 尿毒癥血清對腸道藥物代謝酶的影響51-52
• 5 結(jié)論52-53
• 全文結(jié)論53-54
• 附錄54-56
• 參考文獻56-63
• 致謝63-64
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文64-65
• 附件65

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉志浩;劉克辛;;腸道藥物轉(zhuǎn)運體及其研究方法[J];藥學學報;2011年04期

  本文關(guān)鍵詞：尿毒癥血清對阿托伐他訂在Caco-2細胞模型中轉(zhuǎn)運的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：310381