本文關(guān)鍵詞：攜帶人源化的綠色熒光蛋白膀胱癌組織特異性報(bào)告基因腺病毒的構(gòu)建及鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:構(gòu)建攜帶人源化的綠色熒光蛋白(hrGFP,humanizedgreen fluorescentprotein)膀胱癌組織特異性報(bào)告基因腺病毒載體Ad5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP,為檢測(cè)膀胱癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞提供了一種新的檢測(cè)方法。方法:根據(jù)圖譜選取BglII和PmeI兩種限制性內(nèi)切酶分別對(duì)pShuttle-CMV-IRES-hrGFP和pShuttle-PSCAE-UPII-E1A進(jìn)行分步酶切,pShuttle-CMV-IRES-hrGFP酶切后獲得IRES-hrGFP目的片段,pShuttle-PSCAE-UPII-E1A酶切后獲得PSCAE-UPII-E1A目的片段,對(duì)IRES-hrGFP目的片段和PSCAE-UPII-E1A目的片段進(jìn)行膠回收。將回收得的兩個(gè)片段IRES-hrGFP目的片段和PSCAE-UPII-E1A目的片段使用T4連接酶連接,16°恒溫箱過夜,連接液轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中、涂板,16小時(shí)后選取陽(yáng)性克隆,過夜搖菌,用菌液聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、基因測(cè)序(IRES-hr GFP片段)鑒定新構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP。將pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hr GFP用酶PmeI線性化后,電擊法轉(zhuǎn)化到含pAdEasy的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化、涂板后選取陽(yáng)性克隆,過夜搖菌,重組后的質(zhì)粒Ad-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP經(jīng)過酶切(PacI、BsphI)、菌液PCR鑒定正確后,通過脂質(zhì)體lipfectamine2000轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞HEK293,包裝成膀胱癌組織特異性報(bào)告基因腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP。結(jié)果:pShuttle-CMV-IRES-hrGFP和pShuttle-PSCAE-UPII-E1A經(jīng)過BglII和PmeI酶切后膠回收目的片段,將兩個(gè)目的片段用T4連接酶連接,形成新的穿梭質(zhì)粒pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP,新構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒pShuttle-PSCAEUPII-E1 A-IRES-hrGFP經(jīng)PCR鑒定和IRES-hr GFP基因測(cè)序鑒定,成功后利用細(xì)菌內(nèi)同源重組法制備出組織特異性膀胱癌的腺病毒載體pAd-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP,經(jīng)酶切和PCR鑒定后,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至HEK293,熒光顯微鏡觀察到hrGFP基因的表達(dá),包裝成報(bào)告基因腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP,經(jīng)四輪擴(kuò)增純化后,測(cè)得病毒滴度為1.87×1011pfu/ml。結(jié)論:利用酶切從兩個(gè)穿梭質(zhì)粒中相應(yīng)的獲取所需的片段,通過連接反應(yīng)形成新的pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP。細(xì)菌內(nèi)同源重組法成功構(gòu)建出pAd5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP重組腺病毒質(zhì)粒。制備出的報(bào)告基因重組腺病毒為檢測(cè)膀胱癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：膀胱癌 循環(huán)腫瘤細(xì)胞 UPIIX啟動(dòng)子 人源化綠色熒光蛋白 重組腺病毒 HEK293細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.14
【目錄】：

• 英文縮寫索引3-4
• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-14
• 材料和方法14-27
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料14-16
• 1.1.1 質(zhì)粒、載體和細(xì)菌菌株14
• 1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑14
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑盒14
• 1.1.4 儀器及設(shè)備14-15
• 1.1.5 主要溶液及配制15-16
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法16-27
• 1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成16-17
• 1.2.2 構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP17-21
• 1.2.3 同源重組法制備重組質(zhì)粒pAd5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP21-25
• 1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及包裝病毒25-27
• 結(jié)果27-29
• 2.1 穿梭質(zhì)粒的鑒定pShuttle-PSCAE-UPII-E1A27
• 2.2 重組病毒質(zhì)粒的鑒定pAd5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hr GFP27-28
• 2.3 轉(zhuǎn)染48小時(shí)后、7 天后分別用熒光顯微鏡觀察hr GFP基因表達(dá)情況28-29
• 討論29-32
• 結(jié)論32-33
• 參考文獻(xiàn)33-37
• 文獻(xiàn)綜述37-44
• 綜述參考文獻(xiàn)42-44
• 在校期間的研究成果44-45
• 致謝45

【相似文獻(xiàn)】

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1 薛麗香,童坦君,張宗玉;報(bào)告基因的選擇及其研究趨向[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2002年04期

2 陳振花,呂秋軍,溫利青,葉棋濃,曹穎林,周俠;基于報(bào)告基因和干擾素-α信號(hào)通路的藥物篩選模型的建立[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2005年02期

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5 王勁茗;凌均h

本文編號(hào)：310505