本文關(guān)鍵詞：CXCR4與eEF1A1相互作用與腎癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【目的】腎癌是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤,約有三分之一的腎癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)即已為晚期。轉(zhuǎn)移性腎癌目前尚無有效治療方法,五年生存率不到20%,嚴(yán)重影響我國人民的生命健康。CXCR4是一種趨化因子,在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理病理功能。國內(nèi)外大量研究證據(jù)表明CXCR4與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān),現(xiàn)在認(rèn)為其活化后可以激活下游多種信號(hào)通路從而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)指在探尋CXCR4在腎癌細(xì)胞中相互作用的蛋白和DNA,豐富CXCR4促進(jìn)腎癌轉(zhuǎn)移的通路�！狙芯糠椒ā�1.課題組已構(gòu)建包裝高表達(dá)CXCR4-EGFP的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染病毒得到過表達(dá)CXCR4的腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN,并通過實(shí)時(shí)熒光顯微鏡和定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。2.利用蛋白質(zhì)免疫共沉淀、染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)ACHN細(xì)胞內(nèi)與CXCR4相互作用的蛋白和DNA,通過質(zhì)譜分析和測(cè)序分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)與ACHN相互作用的蛋白和DNA。3.針對(duì)質(zhì)譜分析的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。質(zhì)譜分析得到與CXCR4結(jié)合的蛋白有e EF1A1(Eukrryotic Translation Elongation Factor 1 Alpha 1,e EF1A1)。設(shè)計(jì)相對(duì)應(yīng)的si RNA使其低表達(dá),包裝干擾慢病毒,轉(zhuǎn)染,構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)的ACHN細(xì)胞系。4.通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移和實(shí)驗(yàn)研究其與腎癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系。進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn),對(duì)轉(zhuǎn)染EGFP慢病毒的ACHN細(xì)胞,e EF1A1干擾的ACHN-EGFP細(xì)胞,高表達(dá)CXCR4的ACHN-CXCR4細(xì)胞及干擾e EF1A1的ACHN-CXCR4細(xì)胞進(jìn)行CCK8增殖、流式細(xì)胞凋亡、Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn),探討e EF1A1對(duì)腎癌細(xì)胞功能的影響,并通過比較在CXCR4高表達(dá)時(shí)敲低e EF1A1表達(dá)來初步探討CXCR4與e EF1A1相互作用對(duì)腎癌細(xì)胞功能的影響。5.選取98例腎癌標(biāo)本構(gòu)建組織芯片,進(jìn)行免疫組化染色,統(tǒng)計(jì)各標(biāo)本e EF1A1表達(dá)量的高低,結(jié)合患者的預(yù)后,初步探討e EF1A1與腎癌預(yù)后的關(guān)系�！緦�(shí)驗(yàn)結(jié)果】1.構(gòu)建過表達(dá)CXCR4-EGFP融合蛋白的腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)染ACHN細(xì)胞,熒光顯微鏡下可見ACHN細(xì)胞90%發(fā)出綠色熒光,實(shí)時(shí)定量PCR顯示轉(zhuǎn)染CXCR4-EGFP過表達(dá)病毒后ACHN內(nèi)CXCR4表達(dá)量提高7499倍,蛋白質(zhì)免疫印跡顯示融合蛋白大量表達(dá)。2.免疫共沉淀獲取和CXCR4相互作用的蛋白質(zhì),跑膠后送質(zhì)譜分析,質(zhì)譜分析提示約在50KDa位置存在條帶可能是e EF1A1。進(jìn)一步通過western驗(yàn)證此結(jié)論,在50KDa附近位置加入e EF1A1一抗,有明確條帶顯示,證實(shí)腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN內(nèi)CXCR4與e EF1A1存在相互作用。3.通過查詢基因數(shù)據(jù)庫,設(shè)計(jì)e EF1A1的干擾RNA,干擾序列為GCACCAUGAAGCUUUGAGUGAAGCTT GCUUCACUCAAAGCUUCAUGGUGCTT。此序列構(gòu)建sh RNA干擾慢病毒并轉(zhuǎn)染ACHN細(xì)胞和ACHN-CXCR4細(xì)胞,并通過實(shí)時(shí)定量PCR和western驗(yàn)證干擾效率約為70%,即干擾組e EF1A1的表達(dá)量下調(diào)70%,至此構(gòu)建e EF1A1干擾慢病毒并構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ACHN細(xì)胞系成功。4.細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾e EF1A1后腎癌細(xì)胞的凋亡稍增加,增殖減慢,遷移無明顯變化。高表達(dá)CXCR4的ACHN-CXCR4在干擾掉e EF1A1后凋亡明顯增加,增殖減慢幅度更大,而遷移能力無明顯變化。提示e EF1A1增強(qiáng)了腎癌細(xì)胞的增殖能力,而其部分機(jī)制可能是通過與CXCR4相互作用實(shí)現(xiàn)的。而e EF1A1對(duì)腎癌細(xì)胞的遷移能力無明顯影響。5.組織芯片顯示e EF1A1高表達(dá)的腎癌預(yù)后較差�！緦�(shí)驗(yàn)結(jié)論】CXCR4和e EF1A1在腎癌細(xì)胞ACHN內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞的增殖,其相互作用更增加了這一趨勢(shì)。腎癌組織中高表達(dá)e EF1A1提示預(yù)后不良。
【關(guān)鍵詞】：腎癌 轉(zhuǎn)移 CXCR4 eEF1A1
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.11
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 英文縮略詞表12-13
• 前言13-16
• 第一部分 腎癌細(xì)胞ACHN中CXCR4與e EF1A1相互作用16-47
• 一、材料17-19
• 二、方法19-37
• 三、結(jié)果37-42
• 四、討論42-46
• 五、結(jié)論46-47
• 第二部分 腎癌細(xì)胞內(nèi)e EF1A1促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且與CXCR4相互作用增強(qiáng)了此功能47-61
• 一、材料48-49
• 二、方法49-52
• 三、結(jié)果52-58
• 四、討論58-59
• 五、結(jié)論59-61
• 第三部分 高表達(dá)e EF1A1腎癌患者預(yù)后差61-68
• 一、材料62
• 二、方法62
• 三、結(jié)果62-66
• 四、討論66-67
• 五、結(jié)論67-68
• 參考文獻(xiàn)68-70
• 附錄70-71
• 綜述71-76
• 參考文獻(xiàn)74-76
• 發(fā)表文章情況76-77
• 致謝77-78

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 鮑一;王志向;李鵬;陳俊明;劉冰;楊慶;高莉;吳震杰;王林輝;;eEF1A1在T_1N_0M_0期腎癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2015年07期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 馮爍;宿主細(xì)胞eEF1A蛋白與豬瘟病毒NS5A蛋白的相互作用及其對(duì)豬瘟病毒的抑制作用研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

  本文關(guān)鍵詞：CXCR4與eEF1A1相互作用與腎癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：302570