目的構(gòu)建小鼠IFN-ε蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒,誘導(dǎo)表達(dá)和純化后獲得穩(wěn)定的可溶性重組蛋白并驗(yàn)證其生物學(xué)活性。建立絕經(jīng)后泌尿系感染的小鼠模型,觀察IFN-ε對其治療作用。方法1.將目的基因克隆到表達(dá)載體p ET28a-SUMO,和能同時(shí)表達(dá)三個(gè)分子伴侶gro ES、gro EL和tig的質(zhì)粒p G-tf2一起轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）,用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)。通過Ni-NTA親和層析柱、Desalting柱、Q-HP柱及Superdex75分子篩層析經(jīng)行純化后,用Ulp1酶切,并對目標(biāo)蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析。對目標(biāo)蛋白抑制腫瘤細(xì)胞增長活性,刺激細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白的活性進(jìn)行了鑒定。2.選取IC R雌性健康小鼠分為兩組,去勢組和假手術(shù)組,并通過雌激素測定、陰道涂片的方法驗(yàn)證去勢效果。用50μl UPEC對去勢小鼠進(jìn)行膀胱灌注,建立絕經(jīng)后泌尿系感染的小鼠模型,24小時(shí)后處死小鼠,收集膀胱和尿液標(biāo)本,將膀胱分為兩部分,一部分和尿液標(biāo)本一起進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),另一部分常規(guī)病理切片,觀察結(jié)果。按照上述方法建立絕經(jīng)后泌尿系感染小鼠模型,分為去勢感染組和去勢感染治療組,治療組分別... 

【文章來源】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

marker;1)小鼠IFN-ε的電泳產(chǎn)物

-ε 基因的 PCR 電泳圖. M) marker; 1) 小鼠 IFN-ε 的電泳產(chǎn)物。 b) :M) m鼠 IFN-ε 的電泳圖; 2) 重組質(zhì)粒 pET28a-SUMO-IFN-ε 的電泳圖圖 2-2-1 小鼠 IFN-ε 基因 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果和重組質(zhì)粒的 PCR 驗(yàn)證重組質(zhì)粒和分子伴侶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、表達(dá)和電泳質(zhì)粒pET28a-SUMO-IFN-ε 分別和分子伴侶質(zhì)粒pTf16、pG-tf2 及21(DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)小鼠 IFN-ε 蛋白。把培養(yǎng)后的細(xì)菌離心后ter 破碎菌體后離心，分別收集上清和沉淀并進(jìn)行 SDS-PAGE 凝質(zhì)粒 pET28a-SUMO-IFN-ε 和分子伴侶 pG-tf2 一起表達(dá)時(shí)能生 蛋白量最多。

粒 pET28a-SUMO-IFN-ε 和分子伴侶質(zhì)粒 pG-KJE8 在上清中表達(dá)的蛋白；6) 重組質(zhì)粒 pET28a-SUMO-IFN-ε 和分子伴侶質(zhì)粒 pG-KJE8 在沉淀中表達(dá)的蛋白；7) 重組質(zhì)粒 pET28a-SUMO-IFN-ε和分子伴侶質(zhì)粒 pTf16 在上清中表達(dá)的蛋白；8) 重組質(zhì)粒 pET28a-SUMO-IFN-ε 和分子伴侶質(zhì)粒pTf16 在沉淀中表達(dá)的蛋白； M) 蛋白 marker2.2.3 重組小鼠 IFN-ε 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將重組質(zhì)粒pET28a-SUMO-IFN-ε 和分子伴侶質(zhì)粒pG-tf2同時(shí)轉(zhuǎn)化至 BL21(DE3)，過夜培養(yǎng)后挑取單克隆培養(yǎng)，然后再擴(kuò)大培養(yǎng)至 4L，用濃度為 0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。收集的菌體重懸后在 4℃下高壓破碎、離心、抽濾后得到清亮液體400 m 左右，依次經(jīng)過 Ni 離子親和層析、脫鹽、陰離子交換層析和凝膠過濾層析后，在 57.05 ml 洗脫體積處出現(xiàn)洗脫峰峰值。在每一步純化后各取 50 ul 樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，結(jié)果顯示在分子量 Mr34000 處有單一條帶，和 SUMO-IFN-ε 融合蛋白的大小相同。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]人IFN-ε的表達(dá)、純化及生物學(xué)特性研究[J]. 李莉莉,張振龍.  中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志. 2008 (08)



本文編號：2904985