目的:檢測并驗證體外正常糖、高糖、高糖+VX-765(caspase-1抑制劑)培養(yǎng)的HK-2細胞(人近端腎小管上皮細胞)circRNA差異表達譜,探索可能參與糖尿病腎病腎小管間質(zhì)病變炎癥及焦亡發(fā)病機制的circRNAs。方法:體外培養(yǎng)的HK-2細胞分為3組:正常糖組、高糖組,高糖+VX-765組,同步培養(yǎng)24小時后trizol提取總RNA。采用Arraystar Human circRNA Array V2芯片檢測3組細胞circRNA的表達水平,Agilent Feature Extraction軟件(版本11.0.1.1)分析采集的陣列圖像,R軟件limma軟件包進行數(shù)據(jù)標準化處理。通過表達倍數(shù)變化(fold change2)確定3組細胞間差異表達的circRNAs,通過分層聚類區(qū)分3組細胞間circRNAs的表達模式,使用基于Target Scan和miRanda的miRNA靶標預(yù)測軟件預(yù)測可能與circRNA相互作用的microRNA。最后根據(jù)表達倍數(shù)及表達量由大到小選擇滿足在高糖VS正常糖組上調(diào),同時在高糖+VX-765 VS高糖組中下調(diào)及在高糖VS正常糖組下調(diào),同時在高糖+VX-765 VS高糖組中上調(diào)的circRNAs各5個進行后續(xù)qRT-PCR驗證及生物信息學(xué)分析。結(jié)合文獻初步探討可能參與糖尿病腎病腎小管間質(zhì)病變炎癥及焦亡發(fā)病機制中的circRNAs。結(jié)果:1.circRNA芯片結(jié)果顯示高糖組與正常糖組相比,表達上調(diào)的circRNAs共92個,表達下調(diào)的circRNA共25個,其中上調(diào)最顯著的是hsa_circRNA_402294(7.0299804倍),下調(diào)最顯著的是hsa_circ RNA_001906(-22.9722809倍)。高糖+VX-765組與高糖組相比,表達上調(diào)的circRNA共有54個,表達下調(diào)的circRNA共有103個,其中上調(diào)最顯著的是hsa_circRNA_404975(100.4332781倍),下調(diào)最顯著的是hsa_circRNA_103142(-21.0658222倍)。2.caspase-1抑制劑(VX-765)可抑制54個circRNAs在高糖狀態(tài)下的高表達、14個circRNAs在高糖狀態(tài)下的低表達。這些circRNAs可能參與糖尿病腎小管間質(zhì)的炎癥及焦亡病變。3.hsa_circRNA_102747,hsa_circRNA_405650,hsa_circRNA_104854經(jīng)qRT-PCR驗證在三組細胞間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義4.每個circRNA均有詳細的注釋信息,均有按照與其競爭結(jié)合強弱關(guān)系排序的5個microRNAs,可進行后續(xù)ceRNA機制分析或其他功能機制探討。結(jié)論:本實驗發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的HK-2細胞,高糖組與正常糖組相比circRNAs譜異常表達,高糖組中加入caspase-1抑制劑(VX-765)后circRNAs表達譜與高糖組相比又發(fā)生顯著改變。circRNAs可能參與糖尿病腎病腎小管間質(zhì)病變,可能與炎癥及焦亡機制有關(guān)。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R587.2;R692.9
【部分圖文】：

用 Agilent G2505CG2505C 掃描雜交后的芯片，結(jié)果如圖 1 所示，均勻、清晰，沒有邊緣化效應(yīng)、刮傷等影響信號值，陽性定位點和區(qū)域明顯，說明芯片結(jié)果可用。正常糖組 高糖組 高糖+VX-765圖1 芯片掃描圖過箱式圖（Box Plot）分析，如圖2所示。可以觀察到三組樣品cir密度值經(jīng)過標準化后平均值接近在一個水平上，數(shù)據(jù)中間的50%范高，數(shù)據(jù)基本符合正態(tài)分布。

位對照區(qū)域明顯，說明芯片結(jié)果可用。正常糖組 高糖組 高糖+VX-765 組圖1 芯片掃描圖通過箱式圖（Box Plot）分析，如圖2所示。可以觀察到三組樣品circRNA原始熒光密度值經(jīng)過標準化后平均值接近在一個水平上，數(shù)據(jù)中間的50%范圍值一致性較高，數(shù)據(jù)基本符合正態(tài)分布。圖2 Box Plot-circRNA通過散點圖（Scatter Plot）分析，如圖3所示，可直觀看到兩組間芯片表達數(shù)據(jù)的分布變化，觀察到兩樣品數(shù)據(jù)總體分布集中趨勢。本實驗選擇circRNA的

Foldchange＞2.0。圖3 Scatter Plot-cirRNA通過分層聚類分析，如圖4所示，證實三組樣品均為同類，可直觀的看出三組細胞中同一circRNA相對表達量高低情況。紅色代表相對高表達，綠色、藍色代表相對低表達。圖4 高糖組、正常糖組、高糖+VX-765組中差異circRNA的分層聚類熱圖
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本文編號：2862436