研究目的:本研究主要探討PHD鋅指蛋白(PHF)14受缺氧誘導因子(HIF)1α誘導以及PHF14在馬兜鈴酸誘導的腎間質(zhì)纖維化中的抑制效應及機制。方法:1.利用前期構(gòu)建PHF14條件敲除小鼠,實驗組小鼠基因型為phf14 flox/flox Cre+,同齡基因型為phf14 flox/flox Cre-的小鼠為對照組。在8-12周齡時,予以他莫西芬連續(xù)5天腹腔注射敲除PHF14,確認實驗組小鼠PHF14成功敲除后,馬兜鈴酸(3mg/kg體重)腹腔注射3周(每3天一次)誘導腎纖維化。6周后處死小鼠,留取腎組織行Masson染色及免疫組化檢測型膠原(Col)、α平滑肌肌動蛋白(α-sma),用Western blot、Real time PCR分別檢測PHF14、Col、α-sma、結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達,留血液標本檢測肌酐、尿素氮。2.大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)予以HIF脯氨酸羥化酶抑制劑DMOG刺激,使細胞內(nèi)HIF-1α升高,另一組同時加入HIF-1α抑制劑KC7F2,抑制HIF-1α表達及入核,使用Western blot、Real time PCR檢測不同時間點(0,1,3,6h)HIF-1α、PHF14和CTGF變化。3.在NRK-52E細胞中,利用染色質(zhì)免疫共沉淀的方法,檢測HIF-1α是否可分別結(jié)合在PHF14與CTGF啟動子區(qū)域。4.利用siRNA技術(shù)干擾NRK-52E細胞中PHF14表達,給予DMOG升高細胞內(nèi)HIF-1α,通過Western blot、Real time PCR檢測CTGF表達。5.在NRK-52E細胞中,應用染色質(zhì)免疫共沉淀的方法明確PHF14是否可結(jié)合在CTGF的啟動子區(qū)域。結(jié)果:1.機體在遭受馬兜鈴酸的纖維化刺激后,敲除PHF14的小鼠纖維化指標Col、α-sma表達較對照組明顯升高。相比野生型小鼠,敲除組小鼠的肌酐、尿素氮的指標明顯升高。2.在細胞水平上,使用DMOG刺激細胞后,PHF14、CTGF的表達也升高,而抑制HIF-1α入核后,PHF14、CTGF的表達增加被抑制。通過染色質(zhì)免疫共沉淀的方法證明了HIF-1α可結(jié)合在PHF14和CTGF的啟動子區(qū)域。3.在細胞水平上干擾PHF14表達后,使用DMOG刺激后CTGF的表達明顯升高,通過染色質(zhì)免疫共沉淀的方法證明PHF14可結(jié)合在CTGF的啟動子區(qū)域。結(jié)論:在馬兜鈴酸誘導的腎纖維化小鼠中,敲除PHF14的小鼠纖維化表型更重,腎功能損害更嚴重。通過細胞水平的研究發(fā)現(xiàn),PHF14和CTGF都可以被HIF-1α誘導,在干擾PHF14表達后CTGF的表達增加,通過染色質(zhì)免疫共沉淀的方法證明PHF14可結(jié)合在CTGF的啟動子區(qū)域。PHF14通過調(diào)控CTGF表達抑制了HIF-1α促纖維化作用的過度激活,本研究進一步闡述了PHF14在抑制纖維化進展中的重要作用。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R692
【部分圖文】：

PHD 鋅指蛋白 14 抑制腎間質(zhì)纖維化中結(jié) 果一、PHF14 lox+/+ Cre+及 PHF14 lox+/+ Cre-基因及他莫西芬誘導敲除后 PHF14 的表達情況普通 PCR 的方法對小鼠的基因型進行鑒定，對篩選出來的小鼠在 莫西芬 3mg/40g 體重連續(xù) 5 天腹腔注射，在第 6 天時每組選取 1 臟行 western blot。通過 western blot 發(fā)現(xiàn) PHF14 lox+/+ Cre+小鼠的下降,差別具有統(tǒng)計學差異。（圖 1-1）

海軍軍醫(yī)大學碩士學位論文time PCR、Masson 染色及免疫組化觀察兩組小鼠纖維化指標表達情況。通過 western blot 可以發(fā)現(xiàn)與對照組小鼠相比，PHF14 敲除小鼠的 Col 1、α-sma表達明顯高于對照組，在 real time PCR 上可得到同樣的結(jié)果。Masson 染色、免疫組化上可以見到 PHF14 敲除小鼠與對照組小鼠相比，其纖維化更重。

圖 1-3 小鼠的腎臟標本 Masson 染色、Col 1、α-SMA 免疫組化結(jié)果由上圖可見，與對照組小鼠相比，PHF14 敲除的小鼠在 Masson 染色上可見其纖維化明顯更重，COL 1 和 α-SMA 的結(jié)果與 Western blot 和 real time PCR 一致，在 PHF14 敲除小鼠的腎組織中二者表達均較對照組明顯升高。三、PHF14 敲除小鼠與對照組小鼠在馬兜鈴酸刺激后腎功能變化情況對予以馬兜鈴酸的小鼠處死時取全血，留取血清檢測其尿素氮、肌酐的表達以體重進行校正后分析兩組小鼠在腎功能上有無差異。通過對比發(fā)現(xiàn)，PHF14敲小鼠的肌酐、尿素氮上升更明顯（圖1-4）。說明 PHF14敲除小鼠在經(jīng)受纖維化刺時，腎功能損害更為嚴重。
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本文編號：2858189