目的:探討孤兒核受體 NR2E1(nuclear receptor subfamily 2,group E,member 1)在小鼠腎臟組織及腎小球系膜細胞中的表達情況,研究NR2E1對高糖條件下腎小球系膜細胞損傷的影響及NR2E1在小鼠糖尿病腎病中的作用。方法:利用蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)、免疫組化及免疫熒光方法檢測NR2E1在小鼠腎臟及腎小球系膜細胞中的表達情況。體外培養(yǎng)小鼠腎小球系膜細胞系SV40MES13,利用慢病毒載體感染技術,建立穩(wěn)定過表達NR2E1(OE-NR2E1)及相應空載對照(OE-Ctrl)細胞系、穩(wěn)定干擾NR2E1表達(KD-NR2E1)及相應空載對照(KD-Ctrl)細胞系。利用噻唑藍法(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra-zoliumbromide,MTT)檢測高糖條件下(30mmol/L 葡萄糖培養(yǎng))各組細胞的增殖活力;實時熒光定量聚合酶鏈反應(Quantitative real time polymerase chain reaction,QRT-PCR)及蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞增殖、炎癥、促纖維化相關基因、Sirtl(silent mating type information regulation 2 homolog 1)、核受體輔助調(diào)節(jié)因子 PGC-lα(Peroxisome proliferator activated receptor-γ coactivator)和 RIP 140(Receptor interaction protein 140)表達。8周齡雄性基因敲除雜合子NR2E1+/-小鼠(KD)與對應的同窩野生型NR2E1+/+小鼠(WT)各20只,隨機分為以下四組:(1)基因敲除雜合子NR2E1+/-小鼠10只,標記為KD組;(2)基因敲除雜合子NR2E1+/-糖尿病腎病小鼠10只,標記為KD-DN組;(3)正常野生型小鼠10只,標記為WT組;(4)野生型糖尿病腎病小鼠10只,標記為WT-DN組。KD-DN組和WT-DN組小鼠按照50 mg/kg體重腹腔注射STZ溶液,連續(xù)5天。WT組和KD組小鼠腹腔注射相應體積的無菌檸檬酸鈉緩沖液(濃度為50mmol/L),連續(xù)5天。血糖超過16.7mmol/L認為糖尿病造模成功。所有小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)12周后,檢測小鼠攝食量、血糖、體重、腎臟指數(shù)、血肌酐、血尿素氮、24小時尿蛋白排泄量。提取腎臟組織,通過PAS染色、Masson染色、免疫組化和Westem-blot方法檢測腎臟糖原積累、膠原纖維沉積及炎癥、促纖維化相關基因、Sirtl及核受體輔助調(diào)節(jié)因子PGC-lα和RIP140的表達情況。結果:核受體NR2E1在小鼠腎臟及SV40 MES13細胞中均存在表達,且NR2E1主要表達于細胞核。在5 mmol/1葡萄糖條件下,過表達NR2E1不影響SV40 MES13細胞的增殖活力和增殖相關基因PCNA、炎癥相關基因NF-κB p-P65及促纖維化基因TGF-βi的表達水平,但能顯著增加Sirtl和PGC-lαα表達、降低RIP140表達。在30 mmol/1葡萄糖條件下,過表達NR2E1可以抑制高糖誘導的SV40MES13細胞增殖、炎癥、促纖維化相關基因表達,升高Sirt1和PGC-1αα降低RIP140表達;而干擾NR2E1表達則可起到相反的作用。KD組與WT組之間,小鼠攝食量、血糖、體重、腎臟指數(shù)、血肌酐、血尿素氮、24小時尿蛋白排泄量、腎臟糖原和膠原纖維積累、炎癥、促纖維化基因、Sirt1、PGC-1α及RIP140表達均無明顯差異。與WT組相比,WT-DN組小鼠體重下降、Sirt1和PGC-1α表達明顯降低,攝食量、血糖、腎臟指數(shù)、血肌酐、血尿素氮、24小時尿蛋白排泄量明顯升高,糖原及膠原纖維沉積、系膜基質(zhì)增生明顯,RIP140、炎癥相關基因和促纖維化基因表達明顯升高。與WT-DN組相比,KD-DN組小鼠Sirt1和PGC-1α表達進一步降低,攝食量、血糖、腎臟指數(shù)、血肌酐、血尿素氮、24小時尿蛋白排泄量則進一步升高,糖原及膠原纖維沉積、系膜基質(zhì)增生更顯著,RIP140、炎癥相關基因和促纖維化基因表達進一步增加。結論:NR2E1在小鼠腎臟和腎小球系膜細胞中存在表達,上調(diào)NR2E1能改善高糖誘導的腎小球系膜細胞損傷;NR2E1表達降低促進小鼠糖尿病腎病的進展;NR2E1可能是通過調(diào)控Sirt1、PGC-1α和RIP140表達發(fā)揮作用的。
【學位單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R587.2;R692.9
【部分圖文】：

?武漢大學博士學位論文???３結果??３．１?ＮＲ２Ｅ１在小鼠腎臟組織和腎小球系膜細胞中的表達分析??利用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ方法分析成年雄性Ｃ５７小鼠腎臟組織，結果表明在小鼠腎??臟中存在ＮＲ２Ｅ１表達（圖１．１Ａ）。免疫組織化學分析顯示，ＮＲ２Ｅ１在小鼠腎臟??中存在表達，且ＮＲ２Ｅ１主要表達于腎小球，在腎間質(zhì)表達較弱（圖１．１Ｂ）。??為了進一步分析ＮＲ２Ｅ１在小鼠腎小球系膜細胞中的表達情況，我們采用??Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ和免疫熒光法分析，結果顯示ＳＶ４０?ＭＥＳ１３細胞中存在ＮＲ２Ｅ１表達，??且主要表達于細胞核，在胞漿中存在較弱表達（圖１．２）。??

３．１?ＮＲ２Ｅ１在小鼠腎臟組織和腎小球系膜細胞中的表達分析??利用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ方法分析成年雄性Ｃ５７小鼠腎臟組織，結果表明在小鼠腎??臟中存在ＮＲ２Ｅ１表達（圖１．１Ａ）。免疫組織化學分析顯示，ＮＲ２Ｅ１在小鼠腎臟??中存在表達，且ＮＲ２Ｅ１主要表達于腎小球，在腎間質(zhì)表達較弱（圖１．１Ｂ）。??為了進一步分析ＮＲ２Ｅ１在小鼠腎小球系膜細胞中的表達情況，我們采用??Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ和免疫熒光法分析，結果顯示ＳＶ４０?ＭＥＳ１３細胞中存在ＮＲ２Ｅ１表達，??且主要表達于細胞核，在胞漿中存在較弱表達（圖１．２）。??Ａ?Ｂ??Ｉ：霍自義??３藤；和於、．??Ｎ?，?■？?ｆ?＼?／??？，＊．?■＊－?？?？?？??＊？?Ｃｌ：ｔ?＊?＇?ｍ?？？?？??圖１．１?ＮＲ２Ｅ１在小鼠腎臟組織中的表達分析??注：Ａ

件下其表達水平顯著升高，但是隨著刺激時間的延長（３６?ｈ，?４８?ｈ），其表達水平??呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，至４８?ｈ時，己明顯低于對照組。在后續(xù)研究中，我們使??用葡萄糖作用時間為４８?ｈ。（圖１．３）??由于本研宄中我們使用的葡萄糖濃度較高（３０?ｍｍｏｌ／ｌ），培養(yǎng)條件滲透壓較對??照組（ＳＶ４０?ＭＥＳ１３組，葡萄糖濃度為５?ｍｍｏｌ／ｌ）也升高。為了排除ＮＲ２Ｅ１表??達的改變是由于滲透壓的升高所導致，我們設置了甘露醇組（ｈｉｇｈｍａｍｉｉｔｏｌ，?ＨＭ??組，甘露醇濃度為２５?ｍｍｏｌ／１，作用時間為４８?ｈ），結果發(fā)現(xiàn)，甘露醇組與對照組??之間，ＮＲ２Ｅ１的表達水平差異無統(tǒng)計學意義（ｐ?＞０．０５）。這些結果提示，高濃度??葡萄糖可顯著改變ＳＶ４０ＭＥＳ１３細胞中ＮＲ２Ｅ１的表達水平，并且這種改變不是??由高糖引起的滲透壓升高導致的。（圖１．３）??Ａ?Ｂ?Ｃ??０．６，?８－１??＊禽??￡?丁?＊＊?＜??｜?Ｈ｜?｜?６－
【參考文獻】

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1 李雅;王志斌;劉瑋曄;仝令暢;李玲;張立超;;巨噬細胞與糖尿病腎病[J];國際內(nèi)分泌代謝雜志;2014年06期

2 葉建華;周曉玲;陳孟華;;腎臟血流動力學特點在鑒別早期糖尿病腎病中的價值[J];實用醫(yī)學雜志;2013年03期

3 薛君力;代喆;鄧浩華;陳小奇;孫家忠;鐘紹;徐焱成;;姜黃素調(diào)控炎癥對內(nèi)皮細胞增殖凋亡的影響[J];中華糖尿病雜志;2013年09期

本文編號：2857657