研究背景及目的膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中常見的腫瘤,世界范圍內,膀胱癌最常見的組織學類型是移行細胞癌,占膀胱癌總數(shù)的90%,約75%的初發(fā)者為淺表性膀胱移行細胞癌。其傳統(tǒng)的治療方法是經(jīng)尿道切除病變,然后膀胱內注入化療藥物。由于膀胱癌具有易復發(fā)、轉移及耐藥等生物學特性,因此長期進行膀胱灌注化療的患者,易對藥物產(chǎn)生抵抗,進而加速腫瘤的惡化,導致癌癥相關死亡。故闡明膀胱癌的耐藥機制,以期逆轉耐藥成為膀胱癌臨床治療的關鍵問題。目前對于耐藥機制的研究大多基于編碼基因到蛋白質層面,并不能很好的解釋腫瘤耐藥問題。隨著表觀遺傳學研究的不斷深入,非編碼RNA在醫(yī)學領域引起越來越多的關注。已有相關研究表明非編碼 RNA(non-coding RNAs,ncRNAs),如小 RNA(micro RNA,miRNAs)、長鏈非編碼RNA(long-noncoding RNAs,lnc RNAs)等均參與介導腫瘤耐藥的發(fā)生。然而關于lnc RNAs參與調控人膀胱癌耐藥的機制尚未闡明。為探討lnc RNAs參與人膀胱癌耐藥的具體機制,本研究擬:①構建膀胱癌T24多柔比星耐藥株,驗證耐藥性,初步探討耐藥機制;②高通量測序、生物信息學分析篩選親本株與耐藥株差異表達的lnc RNAs。研究方法采用體外大濃度多柔比星(Doxorubicn,DOX)結合時間遞增沖擊誘導構建人膀胱癌多柔比星耐藥細胞株T24/DOX;倒置顯微鏡下觀察不同階段親本株T24、耐藥株T24/DOX細胞形態(tài)學改變;CCK-8法檢測不同階段親本株T24、耐藥株T24/DOX的IC50,計算耐藥指數(shù)(RestitanceIndex,RI);分別繪制親本株T24、耐藥株T24/DOX生長曲線、計算倍增時間,初步衡量T24/DOX細胞耐藥性;平板克隆形成實驗檢測T24親本株和T24/DOX耐藥株的單細胞克隆形成能力;羅丹明123(Rh123)蓄積實驗檢測T24親本株和T24/DOX耐藥株細胞內羅丹明蓄積量,檢測耐藥相關蛋白P-gp的活性;PI/Hoechst33342雙染檢測T24親本株和T24/DOX耐藥株在不同藥物濃度下的細胞凋亡率;Western Blot檢測T24親本株和T24/DOX耐藥株細胞內耐藥相關蛋白的表達,初步探索T24/DOX耐藥機制;采用皮下移植瘤法建立T24親本株、T24/DOX耐藥株的裸鼠移植瘤耐藥模型,在體驗證T24/DOX耐藥性及其機制;高通量測序篩選T24親本株和T24/DOX耐藥株差異表達的lnc RNA。研究結果1.T24/DOX耐藥細胞株建立:成功建立了人膀胱癌T24/DOX耐藥細胞株(耐藥株與親本株同源);親本株T24和耐藥株T24/DOX的IC50值分別為247.6 ng/ml、3221 ng/ml,RI 為 13.01。2.耐藥性的驗證:倒置顯微鏡下可觀察到耐藥株T24/DOX較親本株T24細胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變,變形細胞比例增大;細胞生長曲線顯示,親本株T24和耐藥株T24/DOX細胞的倍增時間分別為(53.41 ± 8.24)h和(44.36 ± 6.64)h,即與親本株T24相比,T24/DOX耐藥細胞株的倍增時間延長(P0.05)。親本株T24和耐藥株T24/DOX細胞克隆形成率分別為(18.4±1.83)%和(44.93±3.03)%,與T24細胞相比,T24/DOX克隆形成率明顯增多(P0.01);Rh123蓄積實驗結果顯示,與T24細胞(6.43±0.75%)相比,T24/DOX耐藥細胞內熒光強度明顯減弱,陽性細胞率也明顯減少(2.15±0.81)%(P0.01);PI/Hoechst33342染色結果顯示在不同的藥物濃度(DOX 2.5、1.25、0.625 μg/ml)作用下,與T24細胞相比,T24/DOX紅色熒光均減少(P0.05);成功建立裸鼠移植瘤體內耐藥模型,成瘤率大于90%。T24裸鼠移植瘤抑瘤率為76.18%,T24/DOX裸鼠移植瘤抑瘤率為32.23%(P0.05)在體實驗發(fā)現(xiàn)T24/DOX具有明顯的耐藥性。3.T24親本株與T24/DOX耐藥株中耐藥相關蛋白的表達:與T24細胞相比,T24/DOX耐藥細胞株中Bcl-2表達量升高,Bax/Bcl-2比率顯著降低(P0.05),P-gp蛋白表達量升高(P0.01),caspase-3的表達降低(P0.05);裸鼠移植瘤組織中蛋白表達,在對照組中與T24裸鼠移植瘤相比,T24/DOX組Bcl-2表達量升高,Bax表達量降低,Bax/Bcl-2比值降低(P0.01),Caspase-3的表達降低(P0.01);在給藥組中與DOXT24裸鼠移植瘤相比,組Bcl-2表達量升高,Bax表達量降低,Bax/Bcl-2比值降低(P0.05),Caspase-3的表達降低(P0.05),裸鼠瘤組織中蛋白表達情況與細胞中表達情況一致。4.高通量測序結果:分別對T24、T24/DOX(RI分別為6.12和13.01)三株細胞進行高通量測序,篩選出292個新lnc RNAs。與T24細胞相比,T24/DOX(RI分別為6.12和13.01)中具有差異表達的lnc RNAs均有11個,其中兩株耐藥細胞中共有表達的lnc RNAs有5個,分別為MSTRG.14409(FC-1.5)、MSTRG.16907(FC0)、MSTRG.121(FC0)、MSTRG.17(FC0)、MSTRG.16359(FC1.5)。研究結論1.建立了穩(wěn)定的人膀胱癌多柔比星耐藥細胞株T24/DOX;2.T24/DOX的耐藥機制與抑制細胞凋亡、P-gp蛋白的表達升高有關;3.高通量測序結果顯示,耐藥株T24/DOX與親本株T24存在異常表達的lnc RNAs。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737.14
【部分圖文】：

（Ａ）?Ｔ２４?（Ｂ）?Ｔ２４／ＤＯＸ??１．３．２?Ｔ２４／ＤＯＸ耐藥株的建立??Ｔ２４親本株對ＤＯＸ的ＩＣ５Ｑ為２４７．６ｎｇ／ｍｌ。經(jīng)過歷時１０個月的誘導，檢的ＤＯＸ對細胞的ＩＣ５Ｑ，觀察Ｔ２４／ＤＯＸ耐藥株耐藥指數(shù)的變化。Ｔ２４／ＤＯ逐漸變大，最終為３２２１?ｎｇ／ｍｌ，耐藥指數(shù)達到１３．０１，誘導后的Ｔ２４細胞感性顯著降低，呈現(xiàn)出明顯的耐藥性。??ｊ２４?Ｔ２４?２．５ｎｇ／ｍｌ?８ｈ（３）??〇〇－｜?？?�。�？＊？＊？??Ｉｓ?Ｓ?１００＃??．?ｉｃ５０＝２４７．６ｎｅ／ｍ］?？?８〇—?ＩＣ５０＝３２２６〇－????Ｉ－?Ｘ???４０＇?＊?＇１?４０－?Ｓ?＼??，０－?￡?２０－??０?ｉ?■■?ｉ?■?ｉ?ｉ?〇ｌ?？?？?？?？?ｉ??１?１０?１００?１０００?１００００?１?１０?１００?１０００?１００００?１００Ｄｏｘ（ｎｇ／ｍｌ）?Ｄｏｘ（ｎｇ／ｍＩ）??

１．３．１?Ｔ２４親本株和Ｔ２４／ＤＯＸ耐藥株細胞形態(tài)學的變化??倒置顯微鏡觀察并記錄Ｔ２４親本株和Ｔ２４／ＤＯＸ耐藥株不同階段的細胞形態(tài)學??變化。在顯微鏡下，如圖１．１Ａ所示，Ｔ２４親本株細胞大小均一，形狀規(guī)則。加入??ＤＯＸ刺激，撤藥后約２４?ｈ后可觀察到細胞大量死亡，未發(fā)現(xiàn)形態(tài)上的明顯改變。??期間每兩天更換一次新鮮培養(yǎng)基清除死細胞，剩余的極少數(shù)細胞貼壁生長，剩余的??細胞體積明顯增大，空泡增多，有的細胞出現(xiàn)突起如圖１．１Ｂ所示。隨著撤藥時間??延長，存活的細胞開始恢復生長，但恢復后的細胞體積較大，出現(xiàn)腫脹變形，細胞??形態(tài)表現(xiàn)為大小不一，形狀不規(guī)則，喜聚團生長。??８??

?８??Ｔｉｍｅ?（ｄ）??圖２．１?Ｔ２４和Ｔ２４／ＤＯＸ的細胞生長曲線??２．３．２克隆形成實驗??單細胞獨立生長能力由克隆形成實驗測定，當單個細胞在體外持續(xù)分裂增殖６??次以上，其后代所組成的細胞群體，稱為克隆或者集落，通常情況下，每個克隆含??有５０個以上的細胞。通過計算克隆形成率，可以對細胞獨立生長能力定量分析。??由圖２．２可見，與Ｔ２４親本株（１８．４±?１．８３）?％相比，Ｔ２４／ＤＯＸ耐藥株克隆形成率??（４４．９?±３．０３）?％明顯升高，克隆形成能力較強（蘆＜?０．０１）。由此可見Ｔ２４／ＤＯＸ耐??藥細胞株的增殖能力明顯強于Ｔ２４親本株細胞。??Ａ?Ｂ??Ｔ２４?Ｔ２４／ＤＯＸ??一?５０］??＿?？?Ｖ，４０．??＇／？？？、?１?＿藝??？?＇?＇?Ａ?／?＼?Ｉ?３０－?■！！??１?纏鬚繼藝??ｒ?？?？?坌?２０－?＿＿讓??ｉ?ｐｉｉｎ?ｍｍｍ??’？?．廣?Ｐ－?〇?ｈ?ｔ?１?ｆ麵ｙ?沴?ｊ??？?？?＊?＊?．?Ｆ２４?１２４／１）０?Ｘ??圖２．２Ｔ２４和Ｔ２４／ＤＯＸ克隆形成率（ｎ＝３），?“與Ｔ２４相比，尸＜
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本文編號：2857642