目的:腎小球足細(xì)胞的損傷是蛋白尿產(chǎn)生的關(guān)鍵因素,是腎病綜合征發(fā)病的主要機制,CD2相關(guān)蛋白(CD2-associated protein,CD2AP)是維持足細(xì)胞完整性和減少蛋白尿的最重要的狹縫隔膜蛋白之一。CD2AP缺陷或轉(zhuǎn)錄異常會導(dǎo)致足細(xì)胞衰竭和蛋白尿性腎小球疾病。腎病綜合征患者體內(nèi)存在許多不同小RNA(microRNA,miRNA),它們可能與腎病綜合征的發(fā)生有關(guān)。腎臟中各種細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,包括足細(xì)胞,受miRNA調(diào)節(jié)。一些miRNA的異常表達可導(dǎo)致足細(xì)胞融合和CDAP表達減少。本研究的主要目的是探索通過靶向CD2AP啟動子區(qū)調(diào)節(jié)CD2AP啟動子表達的特異性miR-939,從而為足細(xì)胞損傷的發(fā)病機制創(chuàng)造新的視野,并通過動物模型觀察miR-939阻斷劑對腎病綜合征的治療作用。方法:我們用RegRNA 2.0軟件預(yù)測到在CD2AP的啟動子區(qū)域中有2個miR-939的結(jié)合位點,然而在CD2APmRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-untranslated region,3'-UTR)區(qū)域中沒有miR-939的結(jié)合位點。我們用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)用于檢測miR-939在HEK293細(xì)胞中的位置。通過PCR獲得CD2AP基因啟動子區(qū)的5'側(cè)翼序列,并指向插入到pGL3-Basic,構(gòu)建包含不同長度堿基序列的啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒。載體構(gòu)建成功后通過雙熒光素報告基因檢測系統(tǒng)鑒定啟動子活性。利用點突變/缺失突變技,轉(zhuǎn)染miR-939模擬物/miR-939抑制與啟動子載體共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞中,鑒定miR-939是否可以通過靶向CD2AP啟動子的結(jié)合位點來調(diào)節(jié)CD2AP的表達。轉(zhuǎn)染miR-939后,通過染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecitation,ChIP)檢測人CD2AP啟動子區(qū)域中RNA聚合酶II的富集。腎病綜合征病人外周血中檢測miR-939和CD2AP的表達水平;建立阿霉素誘導(dǎo)的大鼠腎病模型,靜脈注射miR-939阻斷劑,通過腎臟外觀,腎臟病理,血液生化及CD2AP的表達變化,觀察miR-939阻斷劑對腎病綜合征的治療作用。結(jié)果:通過生物信息學(xué)預(yù)測,在CD2AP的啟動子區(qū)域中存在miR-939的兩個特異性結(jié)合位點。FISH實驗和細(xì)胞漿和細(xì)胞核分離后PCR證實miR-939可見于HEK293細(xì)胞的細(xì)胞核中。miR-939通過結(jié)合CD2AP啟動子上-491~-468結(jié)合位點負(fù)向調(diào)控CD2AP啟動子的活性;轉(zhuǎn)染miR-939后ChIP實驗發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶Ⅱ在CD2AP啟動子區(qū)的富集減少。在腎病綜合征病人外周血中miR-939的表達增加而CD2AP的表達降低。miR-939阻斷劑能改善腎病模型中腎臟的外觀,血液生化指標(biāo),減輕腎組織的病變,增加CD2AP的表達量。結(jié)論:CD2AP是miR-939的靶基因,以轉(zhuǎn)錄前調(diào)控方式調(diào)控CD2AP的表達,在細(xì)胞核內(nèi)miR-939通過減少RNA聚合酶Ⅱ在啟動子區(qū)的富集而下調(diào)CD2AP的轉(zhuǎn)錄和表達,miR-939阻斷劑對腎病綜合征有一定的治療作用。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R692
【部分圖文】：

南京醫(yī)科結(jié) 果患兒的外周血單個核細(xì)胞中，miR-939 NA 表達減少。的 SD，在足細(xì)胞完整性中起保護作用。竭和蛋白尿性腎小球疾病。我們先前細(xì)胞中 CD2AP mRNA 的表達。 據(jù)此我們相關(guān)，我們檢測了原發(fā)性 NS 患兒外周血A 的水平，發(fā)現(xiàn) miR-939mRNA 顯著高于著下降。見圖 1.

圖 2. miR-939 對 HEK-293 細(xì)胞中 CD2AP mRNA 3’ 非翻譯區(qū)無調(diào)控作用。圖 2B.構(gòu)建pmiR-RB-report TM-CD2APmRNA 3’ 非翻譯區(qū)報告基因質(zhì)粒，該報告質(zhì)粒包含 SV40 啟動子驅(qū)動的報告熒光，其下游構(gòu)建了 CD2AP mRNA3’ 非翻譯區(qū)區(qū)域，通過對該熒光的檢測，即可驗證 miR-939 是否對 CD2AP mRNA3’ 非翻譯區(qū)有調(diào)控作用。圖 2A.將 pmiR-RB-reportTM-CD2AP mRNA3’UTR 報告基因質(zhì)粒與 miR-939 共同轉(zhuǎn)染于 HEK-293 細(xì)胞中，進行螢

圖 2. miR-939 對 HEK-293 細(xì)胞中 CD2AP mRNA 3’ 非翻譯區(qū)無調(diào)控作用。圖 2B.構(gòu)建pmiR-RB-report TM-CD2APmRNA 3’ 非翻譯區(qū)報告基因質(zhì)粒，該報告質(zhì)粒包含 SV40 啟動子驅(qū)動的報告熒光，其下游構(gòu)建了 CD2AP mRNA3’ 非翻譯區(qū)區(qū)域，通過對該熒光的檢測，即可驗證 miR-939 是否對 CD2AP mRNA3’ 非翻譯區(qū)有調(diào)控作用。圖 2A.將 pmiR-RB-reportTM-CD2AP mRNA3’UTR 報告基因質(zhì)粒與 miR-939 共同轉(zhuǎn)染于 HEK-293 細(xì)胞中，進行螢
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