發(fā)布時間：2020-10-17 06:05

　　 終末期腎病在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率逐年升高,據(jù)統(tǒng)計(jì),我國現(xiàn)有超過100萬的終末期腎病病人。終末期腎病主要有兩種治療方式:透析和腎臟移植,透析只能部分替代腎臟功能,且會引起心血管疾病、骨病等眾多并發(fā)癥,透析患者的長期存活率及生活質(zhì)量較低,此外高額的透析費(fèi)用也為個人、社會和衛(wèi)生系統(tǒng)都帶了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。腎臟移植是目前治療終末期腎病最佳方法,但腎源短缺和移植后免疫排斥問題等嚴(yán)重制約了其廣泛應(yīng)用,我國現(xiàn)有透析等待腎臟移植的患者120萬,每年以十幾萬的數(shù)量增加,每年僅有5000個左右病人能有機(jī)會接受腎臟移植術(shù),大量的病人在等待中經(jīng)受痛苦或死亡。因此,全器官腎臟再生研究最有希望能解決這一臨床問題。近年來干細(xì)胞領(lǐng)域的研究發(fā)展迅速,多能干細(xì)胞具有多種分化能力和無限增殖能力,可以自我更新,在不同的條件下可以分化為不同的人體組織或器官的細(xì)胞。最新的研究成果表明已經(jīng)可以將干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化產(chǎn)生人腎臟祖細(xì)胞,包括中間中胚層(IM)細(xì)胞和后腎間充質(zhì)(MM)細(xì)胞,繼續(xù)將腎臟祖細(xì)胞與胚胎脊髓體外共培養(yǎng),可誘導(dǎo)產(chǎn)生出具有明顯腎小管和腎小球特征的3D腎臟結(jié)構(gòu)。因此多能干細(xì)胞在腎臟再生領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。從多能干細(xì)胞到再生出腎臟,我們須從發(fā)育生物學(xué)角度入手,充分了解腎臟的發(fā)生發(fā)育過程及其分子調(diào)控機(jī)制。哺乳動物的腎臟發(fā)育起源于中胚層,由體節(jié)外側(cè)的細(xì)胞形成生腎索,生腎索頭部發(fā)育為前腎,中部發(fā)育為中腎,尾部發(fā)育為后腎。前腎和中腎隨著胚胎的發(fā)育逐漸退化,而后腎最終發(fā)育為成體腎臟。腎臟發(fā)生從管狀前體細(xì)胞團(tuán)開始,在Wnt9b、Pax8、Fgf8、Wnt4的作用下,細(xì)胞團(tuán)快速增殖到30細(xì)胞左右,接下來Wnt4維持著Pax8、Fgf8、Lhx1等基因的持續(xù)表達(dá),促使細(xì)胞團(tuán)變成了小泡體,隨后Brn1/Pou3f3轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá),小泡體繼續(xù)發(fā)育為逗號小體和S小體,足狀突細(xì)胞在Wt1的作用下發(fā)育成為足細(xì)胞,近、遠(yuǎn)端小管前體細(xì)胞則形成復(fù)雜的纏繞,與集合管融合在一起。目前基于干細(xì)胞的腎臟再生研究主要有六種策略:胚胎后腎移植、腎臟脫細(xì)胞支架再灌注、囊胚互補(bǔ)、體外誘導(dǎo)干細(xì)胞生成腎臟類器官、后腎微環(huán)境誘導(dǎo)干細(xì)胞向腎系細(xì)胞分化以及生物人工腎等,這六種方法均能再生出腎系細(xì)胞,有的甚至能發(fā)揮部分腎功能,但均因血管化不足、免疫排斥、細(xì)胞數(shù)量不足等原因,不能再生出完整腎臟。囊胚互補(bǔ)方法是在sall1基因缺失小鼠的囊胚階段,注射外源干細(xì)胞進(jìn)入囊胚腔,使外源干細(xì)胞與囊胚共同發(fā)育,形成嵌合體,進(jìn)而獲得由外源干細(xì)胞為主要細(xì)胞構(gòu)成成分的腎臟,此方法可獲得形態(tài)完整的腎臟且細(xì)胞來源可控,但由于sall1基因調(diào)控腎臟發(fā)育并不影響血管生成,所以再生腎臟的血管系統(tǒng)來源于嵌合體,且由于囊胚期注射外源干細(xì)胞,嵌合體的動物帶來了嚴(yán)峻的倫理問題。直接誘導(dǎo)多能干細(xì)胞/胚胎干細(xì)胞定向分化為腎細(xì)胞,干細(xì)胞具有多能性,在體內(nèi)可以向任何細(xì)胞類型分化,并自我組裝成組織器官。通過向培養(yǎng)基中添加多種生長因子,誘導(dǎo)干細(xì)胞向腎系細(xì)胞分化,并利用3D培養(yǎng)方法,培養(yǎng)出具有3D結(jié)構(gòu)的腎臟組織。缺點(diǎn)是分化效率較低,無法實(shí)現(xiàn)血管化,最新的研究成果顯示,將體外誘導(dǎo)PSCs分化成的類腎器官移植入裸鼠皮下,成功發(fā)育出血管化的有功能的“小型腎臟”,可以正常過濾血液并產(chǎn)生尿液,這是慢性腎病治療史上一個重要的里程碑。利用后腎微環(huán)境誘導(dǎo)外源干細(xì)胞向腎系細(xì)胞分化,將標(biāo)記的外源干細(xì)胞注射入胚胎腎臟發(fā)育的位置,使后腎微環(huán)境對外源干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),可以獲得來自外源細(xì)胞的嵌合體腎臟,但是獲得的腎臟是胎腎,仍需后腎移植,且體外胚胎的培養(yǎng)技術(shù)難度較大,嵌合體的腎臟仍然有較大的免疫排斥以及倫理問題;生物人工腎是將再生醫(yī)學(xué)和工程科學(xué)技術(shù)結(jié)合起來以創(chuàng)建結(jié)構(gòu)和裝置來代替喪失的組織或器官功能,腎小管輔助裝置(RAD)由近曲小管細(xì)胞工程化組裝而成,與常規(guī)血濾器和體外血液循環(huán)系統(tǒng)相比,RAD能夠在尿毒癥環(huán)境中維持尿毒癥患者急性腎功能衰竭的生存能力。我們選取了后腎移植與脫細(xì)胞支架再灌注兩種腎臟再生方法進(jìn)行比較分析研究,分別闡述了兩種腎臟再生方法的優(yōu)勢及劣勢,總結(jié)了其研究困難與限制因素。胚胎期的腎臟具有強(qiáng)大的分化潛能,后腎階段的細(xì)胞是處于胚胎期的腎臟前體細(xì)胞或者腎臟祖細(xì)胞,這些細(xì)胞除了具有發(fā)育多能性外,還有較低的免疫源性,首先,胚胎早期缺乏識別同種異體抗原或異種抗原的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)。第二,胚胎后腎組織細(xì)胞尚未表達(dá)Ⅰ類和Ⅱ類組織相容性抗原。第三,相對于成體組織,胚胎腎臟組織引起的免疫反應(yīng)相對較輕。第四,所移植胚胎后腎血供將來源于受體,形成源于受體的血管床,從而減少免疫反應(yīng)。有研究證實(shí)后腎移植可以發(fā)揮部分腎臟的分泌功能,分泌促紅細(xì)胞生成素(EPO)和腎素;后腎移植可以在急性失血動物模型中有效地參與維持血壓的穩(wěn)定;后腎移植可以有效地抑制慢性腎衰動物模型的血管鈣化;還有部分研究比較了體內(nèi)各移植位點(diǎn),包括大網(wǎng)膜、小腸、腹主動脈旁、腎動脈、膀胱、淋巴結(jié),但是腎被膜下移植后腎的生長情況和功能發(fā)揮尚無報(bào)道,腎被膜下移植可以使得移植物與宿主腎臟聚在一起,1.隨著后腎移植物在體內(nèi)的發(fā)育,其可能會與原有腎臟發(fā)生融合,共同擔(dān)負(fù)起腎臟功能;2.后腎移植物生長在腎被膜下,其集合系統(tǒng)可能會與原有腎臟共用,若不能,與宿主輸尿管的對接吻合也較為方便;3.相比大網(wǎng)膜和腹主動脈移植,腎被膜下移植更為簡易,可顯著縮短手術(shù)時間,且不需開腹。因此,腎被膜作為新的移植位點(diǎn)值得深入研究。我們將胚胎期15天(E15)大鼠后腎剝離后,分別移植到單側(cè)腎切除的A組大鼠大網(wǎng)膜中,B組腎被膜下,比較其生長發(fā)育狀態(tài),功能發(fā)揮情況。我們發(fā)現(xiàn):1.兩組中單側(cè)腎切除的大鼠對側(cè)腎臟顯著增生;2.兩組移植的后腎均在移植兩周后顯著生長;3.通過病理檢測到移植物顯著血管化且有明顯的腎小球、腎小管等結(jié)構(gòu),免疫組化顯示PAX2、CD31陽性,說明后腎可以在體內(nèi)血管化并成長為成熟腎臟,OCT4、NANOG、SOX2陰性,說明后腎已經(jīng)分化發(fā)育為成熟的腎系細(xì)胞,已經(jīng)脫離干性,但兩組之間的腎結(jié)構(gòu)和血管化程度均沒有顯著差異;4.從移植物中收集到尿液,尿肌酐ELISA檢測顯示移植物均有部分腎功能但不完全,且兩組之間沒有顯著差異。綜上所述,后腎移植可以產(chǎn)生具備所有成體腎細(xì)胞類型的腎臟組織,經(jīng)過宿主血管化后,可發(fā)揮一定的腎臟功能。與大網(wǎng)膜移植相比,腎被膜下移植的后腎無論是移植物大小還是血管化程度都沒有明顯差異,說明腎被膜可以作為新的后腎移植位點(diǎn)。后腎移植還在維持血壓平衡、抑制血管鈣化等發(fā)揮重要功能,因此后腎可以作為可移植腎臟的一個重要來源。近年來,以細(xì)胞生物學(xué)、材料學(xué)為基礎(chǔ)的組織工程技術(shù)發(fā)展迅速,組織工程的三要素為種子細(xì)胞、生物材料和細(xì)胞與生物材料的結(jié)合。目前已經(jīng)可以利用組織工程技術(shù)再生出多種解剖結(jié)構(gòu)較為簡單的組織,如骨骼、軟骨、血管、膀胱等,這些組織在進(jìn)行體內(nèi)移植時對血管網(wǎng)絡(luò)要求不高,但大器官例如心臟、腎臟等解剖結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜,需要嚴(yán)格的血管供應(yīng)系統(tǒng),簡單的合成材料與種子細(xì)胞的結(jié)合不能實(shí)現(xiàn)器官再生。生物器官脫細(xì)胞支架為組織工程技術(shù)提供了更高級的生物材料,也為大器官的再生提供的新的希望,脫細(xì)胞支架是指通過物理、化學(xué)或兩者結(jié)合的方法將器官中所有的細(xì)胞成分去除,留下器官的3D結(jié)構(gòu),主要成分為細(xì)胞為基質(zhì),此支架中含有大量細(xì)胞誘導(dǎo)因子,所以脫細(xì)胞支架可以為種子細(xì)胞提供微環(huán)境,誘導(dǎo)其定向分化。腎臟脫細(xì)胞支架已經(jīng)在多種哺乳動物中成功制備,如大鼠、豬、猴等。有研究表明在體內(nèi)將腎臟下極三分之一切除后,以腎臟脫細(xì)胞支架補(bǔ)足,4周后發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞支架成功誘導(dǎo)正常腎臟向下極再生。本研究結(jié)合多種脫細(xì)胞試劑,制備大鼠腎臟脫細(xì)胞支架,建立大鼠腎臟脫細(xì)胞支架制作平臺及流程體系,然后以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為種子細(xì)胞,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞是一種多能干細(xì)胞,具有向多種細(xì)胞類型分化的能力,利用流動持續(xù)灌注方法,向大鼠腎臟脫細(xì)胞支架中灌注種植人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,獲得了具有一定結(jié)構(gòu)及功能的腎臟,并檢測了支架中細(xì)胞貼附和分化情況,評估再生腎臟的功能水平,為組織工程和腎臟再生提供了可靠的研究基礎(chǔ)。通過對比分析后腎移植與脫細(xì)胞支架兩種腎臟再生方法,我們發(fā)現(xiàn)后腎移植可以再生出成體腎的所有細(xì)胞類型,細(xì)胞數(shù)量和血管化水平上也優(yōu)于脫細(xì)胞支架方法,但是仍然有許多關(guān)鍵性問題沒有解決,例如后腎移植應(yīng)用到人類后,存在倫理問題,后腎移植物的長期存活情況尚無報(bào)道。脫細(xì)胞支架再生的腎臟大小更符合成體腎的尺寸,且動靜脈血管保留良好,適合體內(nèi)移植,但此方法目前主要的限制因素為細(xì)胞的貼附量不夠,分布不均勻以及移植后的血栓預(yù)防問題。期待未來有一種腎臟再生方法能涵蓋目前所有方法的優(yōu)勢,再生出完全功能的腎臟。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R699.2
【部分圖文】：

圖１．腎臟結(jié)構(gòu)。??２．腎臟的發(fā)生、發(fā)育過程??哺乳動物的腎臟發(fā)育起源于中胚層，由體節(jié)外側(cè)的細(xì)胞形成生腎索，生腎索??頭部發(fā)育為前腎，中部發(fā)育為中腎，尾部發(fā)育為后腎。前腎和中腎隨著胚胎的發(fā)??

圖２．后腎早期發(fā)育過程。??Ｗｎｔ４由管狀前體細(xì)胞團(tuán)表達(dá)，以自分泌的方式在Ｗｎｔ信號通路早期發(fā)揮作??用，它促進(jìn)了管狀前體細(xì)胞團(tuán)向小泡體方向發(fā)育。Ｗｎｔ９ｂ和Ｗｎｔ４都是通過經(jīng)典??的０心〖６１１丨１１信號通路發(fā)揮作用［３９，４〇］，有研究表明當(dāng)＼＾加４發(fā)生突變，＼＾１％??

圖３．腎臟再生的六種方法
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張永;組織工程學(xué)在生物人工腎小管研究中的應(yīng)用[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2002年01期

本文編號：2844392