原癌基因B細胞淋巴瘤6(B-cell lymphoma 6,BCL6)是一種序列特異性的轉錄抑制因子,其結構包含N端疏水的BTB/POZ區(qū)域和C末端6個kruppel樣的鋅指結構。BCL6通過與靶基因啟動子區(qū)域特異性的DNA序列結合,抑制其轉錄。受BCL6調控的靶基因主要與細胞的活化、分化、凋亡、細胞周期阻滯等相關。BCL6在維持巨噬細胞靜息狀態(tài),終止炎癥的過程中發(fā)揮重要作用。BCL6與輔抑制因子SMRT、NCoR結合,通過抑制炎癥反應,改善小鼠動脈粥樣硬化。本論文包括兩個部分,分別探討了(1)BCL6在高血壓的腎臟炎癥中的作用及其分子機制;(2)BCL6高血壓的血管重構中的作用與機制。一、BCL6通過負調控NLRP3轉錄抑制腎臟炎癥1.背景腎臟的慢性炎癥在高血壓的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,改善腎臟炎癥可能成為降血壓的治療手段。多種炎癥疾病的模型中均存在核苷酸寡聚化結構域樣受體蛋白 3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors family pyrin domain containing 3,NLRP3)炎性小體的激活,然而NLRP3炎性小體在高血壓腎臟損傷中的研究還十分有限。轉錄抑制因子BCL6負性調節(jié)NF-κB的表達,從而抑制NF-κB介導的炎癥反應。已發(fā)現(xiàn)BCL6是自身免疫疾病和癌癥治療的治療靶點。BCL6在高血壓的腎臟炎癥中的作用尚不明確。2.目的本研究擬探討高血壓炎癥模型中BCL6對NLRP3炎性小體的激活和炎癥的作用及其分子機制;并探討慢病毒過表達BCL6對自發(fā)性高血壓大鼠腎臟炎癥的治療作用。3.方法人腎小管上皮細胞系(HK-2)培養(yǎng)在10%FBS和1%雙抗(100 units/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素)的DMEM/F12培養(yǎng)基中,并且保持37℃,5%的CO2飽和濕度。人胚腎細胞系(293ET細胞)培養(yǎng)在10%FBS和1%雙抗(100 units/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中。在體實驗部分采用13周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)和WKY大鼠,隨機各分成兩組。腎實質分別注射BCL6或者對照ERFP的重組慢病毒,為確保BCL6過表達的有效性,2周后再次尾靜脈分別注射BCL6或者對照ERFP的重組慢病毒。2周之后4組大鼠利用Powerlab測壓系統(tǒng)測量清醒狀態(tài)下的尾動脈收縮壓(systolic arterial pressure,SBP)后分別進行取材和急性試驗。利用尿素測定試劑盒和肌酐測定試劑盒檢測血清尿素氮和肌酐的含量。采用蛋白質免疫分析技術(Western blotting)檢測BCL6、NLRP3、含CARD結構域的凋亡相關斑點蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1前體(pro-cysteinyl aspartate specific proteinase 1,pro-caspase-1)前體、中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutropil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)、腎損傷分子-1(Kidney injury molecule-1,kim-1)、胱抑素 C(CystatinC)、白細胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)前體及成熟體和磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)表達。免疫組織化學(Immunohistochemistry,IHC)檢測NLRP3及BCL6的表達。用real-time PCR(RT-PCR)檢測BCL6、NLRP3、IL-1β、白細胞介素-6 Interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosi s factor-α,TNF-α)、趨化因子 C CL2 和 CXCL2的mRNA水平。采用雙熒光素酶報告基因檢測BCL6 與 NLRP3啟動子的結合活性。電泳遷移率變化分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和染色質免疫共沉淀分析(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)等方法研究 BCL6 與 NLRP3 啟動子結合的結合位點。4.結果(1)SHR大鼠腎皮質BCL6 mRNA和蛋白水平下調,NLRP3炎性小體激活。(2)AngⅡ或LPS抑制HK-2細胞的BCL6表達。在HK-2細胞,BCL6過表達不僅減弱AngⅡ引起的NLRP3的表達上調、炎癥和細胞損傷,也減輕LPS引起的NLRP3的表達上調、炎癥。(3)熒光素酶報告基因檢測顯示BCL6通過與NLRP3啟動子結合抑制NLRP3轉錄,EMSA顯示BCL6其結合點位于+283/+296,且這一結果與ChIP實驗結果一致。(4)采用shRNA敲低HK-2細胞的BCL6水平可增加基礎NLRP3、成熟IL-1β的表達和AngⅡ引起的NLRP3和IL-1β高表達,但對組成炎性小體的ASC和pro-caspase-1表達無顯著影。(5)慢病毒介導的BCL6過表達降低SHR的血壓、顯著抑制SHR腎臟的炎性小體激活和炎癥。5.結論BCL6通過抑制NLRP3轉錄減輕HK-2細胞AngⅡ或LPS誘導的炎癥。SHR腎臟皮質中BCL6下調,慢病毒過表達BCL6抑制SHR腎皮質的NLRP3表達和炎癥。二、BCL6抑制高血壓的血管平滑肌細胞的增殖和氧化應激1.背景血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)是血管壁中膜層的主要組成部分,VSMCs增殖在包括高血壓、動脈粥樣硬化和血管狹窄等心血管疾病中發(fā)揮重要作用。正常生理條件下VSMCs呈現(xiàn)低增殖狀態(tài),高血壓血管損傷的病理狀態(tài)下,VSMCs不斷增殖導致血管壁的增厚。VSMCs增殖是血管重構的重要特征,血管重構是高血壓發(fā)病機制的重要原因之一,因此干預高血壓血管重構已成為防治高血壓的重要切入點。然而,BCL6在高血壓血管平滑肌細胞增殖中是否發(fā)揮作用尚不明確。2.目的本研究擬探討B(tài)CL6對高血壓模型中VSMCs增殖的作用及分子機制,并探討B(tài)CL6過表達對SHR血管重構和血壓的影響。3.方法人主動脈VSMCs培養(yǎng)在含10%FBS和1%雙抗(100 units/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素)的F12-K培養(yǎng)基中,并且保持37℃,5%的CO2飽和濕度。在體實驗部分采用SHR和WKY大鼠,隨機各分成兩組,給予慢病毒過表達BCL6。采用Powerlab測壓系統(tǒng)測量大鼠清醒狀態(tài)下的尾動脈收縮壓,利用Western blot檢測BCL6過表達和干擾的有效性。Masson染色(Masson's trichrome staining)檢測主動脈的血管重構情況。利用CCK-8試劑盒檢測BCL6對VSMCs增殖的影響,EdU摻入法檢測BCL6對VSMCs的DNA合成速率的影響。Western blot檢測樣品增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、還原型煙酰胺腺嘌吟二核苷酸磷酸氧化酶 2(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase2,NOX2)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase4,NOX4)和 GADPH 的蛋白表達。RT-PCR 檢測待測樣品 NOX2和NOX4的mRNA表達。Dihydroethidium(DHE)染色檢測活性氧的變化。4.結果(1)過表達BCL6減弱Ang Ⅱ引起的VSMCs增殖,降低Ang Ⅱ引起的VSMCs EdU陽性細胞數(shù)增加和增殖標志蛋白 PCNA的高表達。(2)過表達BCL6減弱Ang Ⅱ引起的VSMCs中NOX4的高表達,減少AngⅡ引起的ROS的產生增加,但是對NOX2的表達無明顯影響。(3)干擾BCL6的表達,加重Ang Ⅱ引起的VSMCs增殖及氧化應激。(4)慢病毒介導的BCL6過表達降低SHR的血壓、顯著抑制SHR血管重構及氧化應激。5.結論BCL6抑制Ang Ⅱ誘導的VSMCs增殖和氧化應激。慢病毒過表達BCL6降低SHR血壓,減輕SHR血管重構和氧化應激.
【學位單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R544.1;R692
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
第一部分: BCL6通過負調控NLRP3轉錄抑制腎臟炎癥
    前言
    材料和方法
    結果
    討論
    結論
    參考文獻
第二部分: BCL6抑制高血壓血管平滑肌細胞的增殖和氧化應激
    前言
    材料和方法
    結果
    討論
    結論
    參考文獻
綜述: NLRP3 炎性小體與腎臟疾病
    參考文獻
英文縮略語
攻讀學位期間發(fā)表研究論文及科研工作情況
致謝

【參考文獻】

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1 Ning Shi;Shi-You Chen;;Mechanisms simultaneously regulate smooth muscle proliferation and differentiation[J];The Journal of Biomedical Research;2014年01期

本文編號：2843208