原癌基因B細(xì)胞淋巴瘤6(B-cell lymphoma 6,BCL6)是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄抑制因子,其結(jié)構(gòu)包含N端疏水的BTB/POZ區(qū)域和C末端6個(gè)kruppel樣的鋅指結(jié)構(gòu)。BCL6通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域特異性的DNA序列結(jié)合,抑制其轉(zhuǎn)錄。受BCL6調(diào)控的靶基因主要與細(xì)胞的活化、分化、凋亡、細(xì)胞周期阻滯等相關(guān)。BCL6在維持巨噬細(xì)胞靜息狀態(tài),終止炎癥的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。BCL6與輔抑制因子SMRT、NCoR結(jié)合,通過(guò)抑制炎癥反應(yīng),改善小鼠動(dòng)脈粥樣硬化。本論文包括兩個(gè)部分,分別探討了(1)BCL6在高血壓的腎臟炎癥中的作用及其分子機(jī)制;(2)BCL6高血壓的血管重構(gòu)中的作用與機(jī)制。一、BCL6通過(guò)負(fù)調(diào)控NLRP3轉(zhuǎn)錄抑制腎臟炎癥1.背景腎臟的慢性炎癥在高血壓的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,改善腎臟炎癥可能成為降血壓的治療手段。多種炎癥疾病的模型中均存在核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白 3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors family pyrin domain containing 3,NLRP3)炎性小體的激活,然而NLRP3炎性小體在高血壓腎臟損傷中的研究還十分有限。轉(zhuǎn)錄抑制因子BCL6負(fù)性調(diào)節(jié)NF-κB的表達(dá),從而抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。已發(fā)現(xiàn)BCL6是自身免疫疾病和癌癥治療的治療靶點(diǎn)。BCL6在高血壓的腎臟炎癥中的作用尚不明確。2.目的本研究擬探討高血壓炎癥模型中BCL6對(duì)NLRP3炎性小體的激活和炎癥的作用及其分子機(jī)制;并探討慢病毒過(guò)表達(dá)BCL6對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腎臟炎癥的治療作用。3.方法人腎小管上皮細(xì)胞系(HK-2)培養(yǎng)在10%FBS和1%雙抗(100 units/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素)的DMEM/F12培養(yǎng)基中,并且保持37℃,5%的CO2飽和濕度。人胚腎細(xì)胞系(293ET細(xì)胞)培養(yǎng)在10%FBS和1%雙抗(100 units/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中。在體實(shí)驗(yàn)部分采用13周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)和WKY大鼠,隨機(jī)各分成兩組。腎實(shí)質(zhì)分別注射BCL6或者對(duì)照ERFP的重組慢病毒,為確保BCL6過(guò)表達(dá)的有效性,2周后再次尾靜脈分別注射BCL6或者對(duì)照ERFP的重組慢病毒。2周之后4組大鼠利用Powerlab測(cè)壓系統(tǒng)測(cè)量清醒狀態(tài)下的尾動(dòng)脈收縮壓(systolic arterial pressure,SBP)后分別進(jìn)行取材和急性試驗(yàn)。利用尿素測(cè)定試劑盒和肌酐測(cè)定試劑盒檢測(cè)血清尿素氮和肌酐的含量。采用蛋白質(zhì)免疫分析技術(shù)(Western blotting)檢測(cè)BCL6、NLRP3、含CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1前體(pro-cysteinyl aspartate specific proteinase 1,pro-caspase-1)前體、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutropil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)、腎損傷分子-1(Kidney injury molecule-1,kim-1)、胱抑素 C(CystatinC)、白細(xì)胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)前體及成熟體和磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)表達(dá)。免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)檢測(cè)NLRP3及BCL6的表達(dá)。用real-time PCR(RT-PCR)檢測(cè)BCL6、NLRP3、IL-1β、白細(xì)胞介素-6 Interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosi s factor-α,TNF-α)、趨化因子 C CL2 和 CXCL2的mRNA水平。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)BCL6 與 NLRP3啟動(dòng)子的結(jié)合活性。電泳遷移率變化分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和染色質(zhì)免疫共沉淀分析(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)等方法研究 BCL6 與 NLRP3 啟動(dòng)子結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)。4.結(jié)果(1)SHR大鼠腎皮質(zhì)BCL6 mRNA和蛋白水平下調(diào),NLRP3炎性小體激活。(2)AngⅡ或LPS抑制HK-2細(xì)胞的BCL6表達(dá)。在HK-2細(xì)胞,BCL6過(guò)表達(dá)不僅減弱AngⅡ引起的NLRP3的表達(dá)上調(diào)、炎癥和細(xì)胞損傷,也減輕LPS引起的NLRP3的表達(dá)上調(diào)、炎癥。(3)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示BCL6通過(guò)與NLRP3啟動(dòng)子結(jié)合抑制NLRP3轉(zhuǎn)錄,EMSA顯示BCL6其結(jié)合點(diǎn)位于+283/+296,且這一結(jié)果與ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。(4)采用shRNA敲低HK-2細(xì)胞的BCL6水平可增加基礎(chǔ)NLRP3、成熟IL-1β的表達(dá)和AngⅡ引起的NLRP3和IL-1β高表達(dá),但對(duì)組成炎性小體的ASC和pro-caspase-1表達(dá)無(wú)顯著影。(5)慢病毒介導(dǎo)的BCL6過(guò)表達(dá)降低SHR的血壓、顯著抑制SHR腎臟的炎性小體激活和炎癥。5.結(jié)論BCL6通過(guò)抑制NLRP3轉(zhuǎn)錄減輕HK-2細(xì)胞AngⅡ或LPS誘導(dǎo)的炎癥。SHR腎臟皮質(zhì)中BCL6下調(diào),慢病毒過(guò)表達(dá)BCL6抑制SHR腎皮質(zhì)的NLRP3表達(dá)和炎癥。二、BCL6抑制高血壓的血管平滑肌細(xì)胞的增殖和氧化應(yīng)激1.背景血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)是血管壁中膜層的主要組成部分,VSMCs增殖在包括高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和血管狹窄等心血管疾病中發(fā)揮重要作用。正常生理?xiàng)l件下VSMCs呈現(xiàn)低增殖狀態(tài),高血壓血管損傷的病理狀態(tài)下,VSMCs不斷增殖導(dǎo)致血管壁的增厚。VSMCs增殖是血管重構(gòu)的重要特征,血管重構(gòu)是高血壓發(fā)病機(jī)制的重要原因之一,因此干預(yù)高血壓血管重構(gòu)已成為防治高血壓的重要切入點(diǎn)。然而,BCL6在高血壓血管平滑肌細(xì)胞增殖中是否發(fā)揮作用尚不明確。2.目的本研究擬探討B(tài)CL6對(duì)高血壓模型中VSMCs增殖的作用及分子機(jī)制,并探討B(tài)CL6過(guò)表達(dá)對(duì)SHR血管重構(gòu)和血壓的影響。3.方法人主動(dòng)脈VSMCs培養(yǎng)在含10%FBS和1%雙抗(100 units/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素)的F12-K培養(yǎng)基中,并且保持37℃,5%的CO2飽和濕度。在體實(shí)驗(yàn)部分采用SHR和WKY大鼠,隨機(jī)各分成兩組,給予慢病毒過(guò)表達(dá)BCL6。采用Powerlab測(cè)壓系統(tǒng)測(cè)量大鼠清醒狀態(tài)下的尾動(dòng)脈收縮壓,利用Western blot檢測(cè)BCL6過(guò)表達(dá)和干擾的有效性。Masson染色(Masson's trichrome staining)檢測(cè)主動(dòng)脈的血管重構(gòu)情況。利用CCK-8試劑盒檢測(cè)BCL6對(duì)VSMCs增殖的影響,EdU摻入法檢測(cè)BCL6對(duì)VSMCs的DNA合成速率的影響。Western blot檢測(cè)樣品增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、還原型煙酰胺腺嘌吟二核苷酸磷酸氧化酶 2(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase2,NOX2)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase4,NOX4)和 GADPH 的蛋白表達(dá)。RT-PCR 檢測(cè)待測(cè)樣品 NOX2和NOX4的mRNA表達(dá)。Dihydroethidium(DHE)染色檢測(cè)活性氧的變化。4.結(jié)果(1)過(guò)表達(dá)BCL6減弱Ang Ⅱ引起的VSMCs增殖,降低Ang Ⅱ引起的VSMCs EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加和增殖標(biāo)志蛋白 PCNA的高表達(dá)。(2)過(guò)表達(dá)BCL6減弱Ang Ⅱ引起的VSMCs中NOX4的高表達(dá),減少AngⅡ引起的ROS的產(chǎn)生增加,但是對(duì)NOX2的表達(dá)無(wú)明顯影響。(3)干擾BCL6的表達(dá),加重Ang Ⅱ引起的VSMCs增殖及氧化應(yīng)激。(4)慢病毒介導(dǎo)的BCL6過(guò)表達(dá)降低SHR的血壓、顯著抑制SHR血管重構(gòu)及氧化應(yīng)激。5.結(jié)論BCL6抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VSMCs增殖和氧化應(yīng)激。慢病毒過(guò)表達(dá)BCL6降低SHR血壓,減輕SHR血管重構(gòu)和氧化應(yīng)激.
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R544.1;R692
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
第一部分: BCL6通過(guò)負(fù)調(diào)控NLRP3轉(zhuǎn)錄抑制腎臟炎癥
    前言
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第二部分: BCL6抑制高血壓血管平滑肌細(xì)胞的增殖和氧化應(yīng)激
    前言
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
綜述: NLRP3 炎性小體與腎臟疾病
    參考文獻(xiàn)
英文縮略語(yǔ)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表研究論文及科研工作情況
致謝

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Ning Shi;Shi-You Chen;;Mechanisms simultaneously regulate smooth muscle proliferation and differentiation[J];The Journal of Biomedical Research;2014年01期

本文編號(hào)：2843208