發(fā)布時間：2020-10-12 02:29

　　 研究背景糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥之一。RAS阻斷劑治療DKD的局限性為:無法有效抑制腎臟局部RAS系統(tǒng)激活,另外會導(dǎo)致局部腎素反饋性升高。因此,尋找有效的全面抑制腎臟局部RAS系統(tǒng)的方法可能是治療DKD的新途徑。早期生長反應(yīng)蛋白1(Early Growth Response Protein 1,Egr1)是 DKD 進(jìn)展中重要的轉(zhuǎn)錄因子之一。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):RAS系統(tǒng)組分包括AGT,renin,ACE,AT1R啟動子上均有Egr1的結(jié)合位點。因此,提出以下科學(xué)假設(shè):Egr1通過上調(diào)RAS系統(tǒng)(AGT,renin,ACE,AT1R)促進(jìn)DKD進(jìn)展,敲減Egr1可以全面抑制腎臟RAS系統(tǒng),延緩DKD進(jìn)展,可能為DKD提供新的治療途徑。方法1動物實驗(1)第一部分:高脂飲食及鏈脲佐菌素誘導(dǎo)C57BL/6小鼠建立DM模型,成模12w處死;(2)第二部分:DM小鼠12-16w采用流體力學(xué)方法每周尾靜脈注射相應(yīng)質(zhì)粒,建立Egr1敲減及Egr1過表達(dá)DM小鼠模型。2細(xì)胞培養(yǎng)人腎近曲小管細(xì)胞(HK2)于RPMI-1640培養(yǎng)基(2.0g/L葡萄糖)+10%FBS中培養(yǎng);小鼠腎小球系膜細(xì)胞(SV40 MES 13)及人胚腎293T細(xì)胞于含1.0g/L糖的DMEM培養(yǎng)基+5%FBS中培養(yǎng),培養(yǎng)箱環(huán)境為:37℃、5%C02,據(jù)細(xì)胞生長情況傳代、換液、鋪板或進(jìn)行其他實驗操作。3細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染的前一天,以60-80%的細(xì)胞密度平均接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中,以無血清培養(yǎng)基饑餓24小時后,使用lipo3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,達(dá)到基因的過表達(dá)或敲減。4實時熒光定量PCR(RT-qPCR)組織及細(xì)胞總RNA使用Trizol提取,一步法逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。使用SYBR試劑進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng),以β-actin作為內(nèi)參,按2-△△Ct方法計算得出目的基因表達(dá)量。5 Western BlotRIPA法裂解并提取組織及細(xì)胞總蛋白。每孔蛋白上樣量為20-50ug。采用10%的SDS-PAGE膠電泳分離樣品蛋白,濕轉(zhuǎn)到PVDF膜(0.45μm)上。然后使用5%脫脂奶粉或BSA封閉,一抗4℃搖床過夜孵育,二抗室溫孵育1h。使用Odyssey近紅外成像系統(tǒng)發(fā)光顯影,采用Gel-Pro analyzer軟件分析結(jié)果。6腎組織病理學(xué)及免疫組化分離并取出腎臟,石蠟包埋后制備3μm組織切片。PAS染色法和Masson染色法用于觀察腎組織的纖維化程度;免疫組織化學(xué)法用于分析Egr1,RAS及纖維化指標(biāo)的表達(dá)情況。7染色質(zhì)免疫共沉淀細(xì)胞分為對照組、TGF-β1(2h)及TGF-β1(48h)刺激組,根據(jù)ChIP-ITR Express kit(Active Motif,Bedford,MA)試劑盒步驟進(jìn)行操作,采用抗Egr1抗體或?qū)φ誌gG來交聯(lián)蛋白質(zhì)-DNA,使用RT-qPCR來檢測富集效應(yīng)。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算富集倍數(shù)。8雙熒光素酶報告基因構(gòu)建ACE熒光素酶質(zhì)粒(GV238-ACE),將不同濃度梯度Egr1質(zhì)粒(pENTER-Egr1)和GV238-ACE共轉(zhuǎn)染,利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組海腎熒光及螢火蟲熒光值。9激光共聚焦腎臟組織切片共染Egr1及AGT抗體,Leica TCS-SL共聚焦顯微鏡下觀察共定位情況。10酶聯(lián)免疫吸附法采用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒分別檢測血葡萄糖、糖化血紅蛋白、肌酐、.血脂、尿白蛋白、腎組織AngII。11統(tǒng)計分析采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù),各指標(biāo)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示。正態(tài)分布兩兩比較采用兩獨立樣本t檢驗,非正態(tài)分布采用Mann-Whitney U檢驗。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。首先進(jìn)行Levene方差齊性檢驗和方差分析,若方差齊(P0.05)且組間均數(shù)有顯著性差異(P0.05),進(jìn)一步采用LSD法作組間多重比較;若方差不齊(P0.05),選擇近似F檢驗Welch法校正;若組間均數(shù)有顯著性差異(P0.05),則采用Dunnett's T3法作多重比較;P0.05時被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1 DM小鼠成模后12w,24h尿白蛋白明顯升高,腎皮質(zhì)中Egr1及RAS(AGT,renin,ACE,AT1R)的mRNA及蛋白表達(dá)水平均升高。2重組人TGF-β1蛋白干預(yù)HK2細(xì)胞后Egr1的mRNA及蛋白水平呈一過性瞬時升高,RAS(AGT,renin,ACE,AT1R)的mRNA及蛋白表達(dá)水平均升高。隨著Egr1 濃度(Oug,1ug,2ug,4ug)升高,AGT,renin,ACE,AT1R mRNA 及蛋白逐漸升高。敲減Egr1后,AGT,renin,ACE,AT1RmRNA及蛋白隨之下調(diào)。3 DM小鼠腎皮質(zhì)激光共聚焦顯示Egr1與AGT共定位。4染色質(zhì)免疫共沉淀實驗證實AGT,renin,ACE,AT1R基因啟動子上存在Egr1的結(jié)合位點,TGF-β1刺激后AGT,renin,ACE,AT1R富集效率增加。5 293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 pENTER-Egr1 質(zhì)粒(0.2,0.4,0.6,0.8,1.Oug)及 ACE 啟動子質(zhì)粒后,螢火蟲熒光素酶活性逐漸升高。6DKD小鼠過表達(dá)Egr1后,24h尿白蛋白明顯升高,血肌酐明顯升高。腎組織AGT,renin,ACE,AT1R 的 mRNA 及蛋白均升高。7 DKD小鼠敲減Egr1后,24h尿白蛋白明顯下降,腎組織AGT,renin,ACE,AT1R mRNA及蛋白均下降。切片藍(lán)染膠原纖維減少,纖維化程度減輕。纖維化因子FN,α-SMAmRNA及蛋白均下降;CTGF及TNF-α蛋白表達(dá)降低。結(jié)論1 RAS 組分(AGT,renin,ACE,AT1R)均是 Egr1 的靶基因。2下調(diào)Egr1可以延緩DKD進(jìn)展,可能的機(jī)制之一為抑制RAS的激活。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R587.2;R692.9
【部分圖文】：

??進(jìn)作用［１２］（圖１）。腎臟組織中存在可以生成Ａｎｇｌｌ的所有組分。免疫熒光發(fā)現(xiàn)??ＡＧＴ定位于近曲小管及腎小球，遠(yuǎn)曲小管及集合管未見陽性結(jié)果［１３＿１５］。體外培??養(yǎng)腎臟近曲小管細(xì)胞可檢測到ｒｅｎｉｎ?ｍＲＮＡ和ｒｅｎｉｎ樣活性，大鼠腎小管液中也檢??測到了低濃度的腎素［１６，１７］。人腎臟近曲小管刷狀緣可檢測到大量ＡＣＥ?ｍＲＮＡ及??蛋白［１８，?１９］，另外近曲小管及遠(yuǎn)曲小管液中檢測到ＡＣＥ，近曲小管液中含量高于??遠(yuǎn)曲小管Ｐ〇］。??既往研宄證實，在ＤＭ狀態(tài)下，與全身循環(huán)ＲＡＳ無關(guān)的腎臟局部ＲＡＳ被激??活是導(dǎo)致ＤＫＤ發(fā)生發(fā)展的重要因素之一［１２］。高糖刺激可以使腎小球和近端小管??Ａｎｇｌｌ生成增多，此時腎臟局部Ａｎｇｌｌ的濃度是血漿的數(shù)倍［２１］�？赡艿臋C(jī)制有：??通過Ｐ３８?ＭＡＰＫ通路可以使近端小管ＡＧＴ基因表達(dá)增加，從而刺激Ａｎｇｌｌ合成［２２］；??高糖作用下腎小球系膜細(xì)胞ＡＧＴ表達(dá)也會明顯升高

Ｅｇｒｌ是腎臟纖維化重要的調(diào)控因子，在ＤＫＤ進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。??經(jīng)生物信息學(xué)分析（ｈｔｔｐ：／／ｊａｓｐａｒ．ｇｅｎｅｒｅｇ．ｎｅｔ／）發(fā)現(xiàn)：ＲＡＳ系統(tǒng)組分包括??ＡＧＴ，?ｒｅｎｉｎ，ＡＣＥ，?ＡＴ１Ｒ啟動子上均有Ｅｇｒｌ的結(jié)合位點（圖２）。因此，Ｅｇｒｌ??可能是調(diào)控腎臟局部ＲＡＳ激活的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，抑制Ｅｇｒｌ可能會全面抑制腎??臟局部ＲＡＳ，從而為治療ＤＫＤ提供新的途徑。本課題組擬通過體內(nèi)外實驗探??索上述科學(xué)假設(shè)。??ｒｅｎｉｎ?ＩＡ０１Ｓ２．２?ＥＧＲ１?１１．３７３?０．９０１９７５３３５２１８２５１?１２４６?１２５９?１?ｃｄｃｃｇｃｃｔｃｃｔｇｇ??ＡＣＥ?動痕?２?ＥＧＲ１?２０?５２６?０．９９９９９６２９９７５５１１１?１９３６?１９４９?－１?ｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃｃｇｃｃ??ＡＧＴ?ＩＡ０ｌＳ２：２?ＥＧＲ１?９．１２０?０?８Ｉ７８４７Ｓ９２０６２８３３?１３２？?１３４０?１?ｇｃｃｔｃａｃｃｃａｃｔｇｃ??ＡＴ１Ｒ?ＩＡ０１Ｅ２?ＥＧＲ１?１０．４９５?０?８９２５７２６９０５２６５２６?１９８１?１９９４?－１?

ｍｍｏ５．８３±０．２１?２２．３０±０．８３糖化血紅蛋白（％）?５．４５±０．５４?９．４５士０．２５”??２４ｈ?尿白蛋白（ｕｇ）?６．１６士０２４?８０．３４±２．２４＊＊??肌酐（ｍｍｏｌ／Ｌ）?１７７．６７±２１．８５?１７４．１８±２．１１??Ｐ＜０．０５ｖｓ?Ｃｏｎｔｒｏｌ，?＊?Ｐ＜０．０１?ｖｓ?Ｃｏｎｔｒｏｌ，?Ｎ＝６??２組織形態(tài)學(xué)檢查??２．１?ＰＡＳ染色法觀察兩組腎組織腎小球及腎小管間質(zhì)膠原纖維的變化??從ＰＡＳ染色結(jié)果觀察到：Ｃｏｎｔｒｏｌ組小鼠的腎組織顯示了正常的腎小球構(gòu)，清晰的Ｂｏｗｍａｎ’ｓ囊和毛細(xì)血管叢，腎小管結(jié)構(gòu)排列整齊。而ＤＭ組小腎小球毛細(xì)血管基底膜明顯增厚，系膜基質(zhì)彌漫性增多，在圖中呈深紫紅色，??腎小管管壁組織疏松水腫、排列紊亂（圖Ｍ）。??Ｃｏｎｔｒｏｌ?ＤＭ??％，?＇?‘?－?－ｖ?－?：?：?Ｔ＇?１??
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Sonoo Mizuiri;Yasushi Ohashi;;ACE and ACE2 in kidney disease[J];World Journal of Nephrology;2015年01期

本文編號：2837498