目的:1.探討HMGB1通過促前列腺間質(zhì)細胞增殖、遷移作用在良性前列腺增生(BPH)發(fā)生過程中起重要作用。2.探討HMGB1通過影響ERK、STAT信號通路的受體作用途徑發(fā)揮促前列腺間質(zhì)細胞增殖的作用。方法:1.購買人前列腺間質(zhì)細胞并進行細胞培養(yǎng)、傳代、凍存,實驗分組:control組、HMGB1(50ng/m1)組、HMGB1(100ng/ml)組、HMGB1(200ng/ml)組;CCK8法檢測細胞活力;EdU實驗檢測細胞增殖;流式細胞儀檢測細胞周期;Transwell遷移實驗檢測細胞遷移能力。2.實驗分組:control組、5min組、10min組、30min組、60min組,用200ng/ml HMGB1刺激前列腺間質(zhì)細胞不同時間點后收集細胞,Western-Blot法檢測并比較不同時間點p-ERK 1/2、p-STAT3蛋白的表達;實驗分組:control組、2h組、4h組、8h組、12h組、24h組,用200ng/ml HMGB1刺激前列腺間質(zhì)細胞不同時間點后收集細胞,Western-Blot法和免疫組化法檢測并比較不同時間點RAGE、TLR4蛋白的表達;實驗分組:control組、HMGB1組、HMGB1+FPS-ZM1(RAGE阻斷劑10ug/ml)組、HMGB1+TAK-242(TLR4阻斷劑1ug/ml)組、FPS-ZM1(10ug/ml)組、TAK-242(1ug/ml)組,用200ng/m1 HMGB1、RAGE阻斷劑和TLR4阻斷劑刺激前列腺間質(zhì)細胞5min后收集細胞,Western-Blot法檢測并比較各組p-ERK 1/2、p-STAT3蛋白的表達,EdU實驗檢測細胞增殖,流式細胞儀檢測細胞周期。結(jié)果:1.給予間質(zhì)細胞不同濃度HMGB1后,與control組和25ng/ml組比較,50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml/、800ng/ml組細胞的增殖活力明顯增加(P0.05),且200ng/ml、400ng/ml/、800ng/ml組之間無明顯差異(P0.05);與control組比較,50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml組細胞EdU的陽性率明顯增加(P0.05),其中100ng/ml、200ng/ml組統(tǒng)計學(xué)意義更明顯(P0.01);與control組比較,100ng/ml、200ng/ml組細胞的細胞周期S期細胞比例明顯增加(P0.05),其中200ng/ml組更明顯(P0.01),與EdU實驗結(jié)果接近;與control組比較,100ng/ml、200ng/ml組細胞的遷移能力也是增加的(P0.05)。2.給予間質(zhì)細胞200ng/mlHMGB1 5min、10min、30min、60min干預(yù)后,與control組比較,5min、10min組p-ERK 1/2、p-STAT3蛋白表達明顯增加(P0.05),其中5min組表達較明顯,且p-STAT3蛋白表達更明顯(P0.01);給予間質(zhì)細胞200ng/ml HMGB1 2h、4h、8h、12h、24h干預(yù)后,與control組比較,4h、8h、12h組RAGE、TLR4蛋白表達明顯增加(P0.05),其中8h組RAGE、TLR4蛋白較其他組表達最明顯,且在胞漿胞膜均有表達,其余無明顯統(tǒng)計學(xué)差異;在給予間質(zhì)細胞HMGB1的基礎(chǔ)上,聯(lián)合給予RAGE阻斷劑后,p-ERK 1/2蛋白表達較單純HMGB1組下降(P0.01),p-STAT3蛋白表達較單純HMGB1組無明顯差異(P0.05),EdU的陽性率較單純HMGB1組也減少(P0.05);在給予間質(zhì)細胞HMGB1的基礎(chǔ)上,聯(lián)合給予TLR4阻斷劑后,p-STAT3蛋白表達較單純HMGB1組下降(P0.05),p-ERK 1/2蛋白表達較單純HMGB1組無明顯差異(P0.05),EdU的陽性率較單純HMGB1組也減少(P0.05);且聯(lián)合RAGE阻斷劑和聯(lián)合TLR4阻斷劑后,較單純HMGB1組間質(zhì)細胞的S期細胞比例也均減少(P0.01)。結(jié)論:1.HMGB1可能通過RAGE、TLR4受體介導(dǎo)的ERK、STAT信號通路促進前列腺間質(zhì)細胞的增殖。2.HMGB1可能通過促進前列腺間質(zhì)細胞的增殖來參與BPH的發(fā)生發(fā)展過程。
【學(xué)位單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R697.3
【部分圖文】：

*p<0.05,**p<0.01 vs. control 組.圖 1 注：A：各組細胞 EdU 的表達情況； B：各組細胞 EdU 陽性率水平的比較圖 1：EdU 實驗檢測各組細胞的增殖情況（×200）Figure 1 note: A: the EdU expression in each group; B: comparison of EdU positive rates ineach groupFigure 1:the proliferation of cells in each group was detected by EdU experiment(×200)3.流式細胞儀檢測不同濃度的 HMGB1 對細胞周期的影響與 control 組比較，G0G1 期細胞基本無明顯變化，200ng/ml 組略有降低(P<0.05)；S 期細胞 100、200ng/ml 組明顯增加(P<0.05)，其中 200ng/ml 組增加更為明顯一些(P<0.01)；G2M期細胞 100、200ng/ml 組減少(P<0.05)，其中 200ng/ml 組減少更為明顯一些(P<0.01)。從結(jié)

*p<0.05,**p<0.01 vs. control 組.圖 2 注：A：各組細胞的周期分布的情況； B：各組細胞的周期分布的比較圖 2：流式細胞儀檢測各組細胞的周期情況Figure 2 note: A: cell cycle distribution in each group; B: comparison of cell cycledistribution in each groupFigure 2: the cell cycle of each group was detected by flow cytometry4.Transwell 實驗檢測不同濃度的 HMGB1 對細胞遷移的影響從小室外觀來看，與 control 組比較，50ng/ml 組染色結(jié)果并無明顯差異，說明細胞遷移能力無明顯改變；100、200ng/ml 組染色較深，說明遷移的細胞明顯增多。從 33%醋酸洗脫下來的結(jié)晶紫染色液 OD 值來看，與 control 組比較，50ng/ml 組的 OD 值無明顯變化（P>0.05），100、200ng/ml 組的 OD 值明顯增加（P<0.05），間接反映遷移的細胞數(shù)目明

5vs. control 組. 3 注：A：各組細胞遷移能力染色的情況； B：各組細胞遷移能力水平的比較圖 3：Transwell 實驗檢測各組細胞的遷移情況gure 3 note:A: staining of cell migration ability in each group; B: comparison of cemigration ability in each groupure 3: the migration of cells in each group was detected by Transwell experime
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本文編號：2837495