前列腺癌是美國男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤,死亡率占惡性腫瘤的第二位。近年來隨著診斷水平的提高,前列腺癌已能做到早期發(fā)現(xiàn),經過標準化的治療,包括根治性前列腺切除、雄激素阻斷、局部放療、冷凍消融和化療等,基本已能治愈或維持現(xiàn)狀。但對那些早期治療失敗或發(fā)現(xiàn)較晚的進展期前列腺癌,仍沒有有效的治療方法。因此,我們迫切需要一種改良的、有效的治療方法,基因治療提供了一種新的方式。RUNX基因家族包括:RUNX1,RUNX2,RUNX3。RUNX1與造血發(fā)生密切相關,其染色體易位在非白血性白血病中常見。RUNX2是成骨發(fā)生必需的,在顱骨鎖骨發(fā)育不良中可見其改變。RUNX3定位于人1p36.1和小鼠第4同源染色體,包含有6個外顯子,P1和P2兩個啟動子。RUNX3作為一個抑癌基因,通過編碼PEBP2/CBF的α亞單位而介入TGF-β信號通路,起著抑制細胞增殖、血管形成及誘導細胞凋亡等作用,RUNX3功能的缺失導致多種腫瘤的發(fā)生。此外,RUNX3與脊髓背根神經節(jié)(DRG)的神經發(fā)生和T細胞分化密切相關。RUNX3基因的雜合性缺失以及P2啟動子區(qū)域的Cp G島的過甲基化是導致RUNX3基因沉默的主要機制,RUNX3蛋白胞漿轉位(由細胞核轉位進入胞漿中)可能是其喪失抑瘤作用的另一種機制。在RUNX3表達缺失的胃癌細胞加入HDAC抑制劑,能重新激活RUNX3基因,引起腫瘤生長抑制及誘導凋亡的發(fā)生。在胃癌細胞系中增強RUNX3的表達可下調cyclin D1,上調p27及caspases3,7,8的表達,誘導凋亡的發(fā)生,進而引起腫瘤生長及遠處轉移的抑制。在RUNX3聯(lián)合阿霉素針對肝細胞癌的體內體外實驗中,RUNX3能增強caspase-8及抑制Bcl-2的表達,抑制腫瘤的生長。RUNX3甲基化在前列腺癌中達到32.4%,在前列腺上皮內瘤變達到14.3%,而在正�；蛄夹郧傲邢倌[瘤組織中未發(fā)現(xiàn),提示RUNX3可能參與前列腺癌發(fā)生的多個環(huán)節(jié)。本實驗應用分子克隆技術構建含轉錄因子RUNX3的重組復制缺陷型腺病毒載體,再感染PC-3前列腺癌細胞,分析RUNX3在PC-3中的表達定位及對其對PC-3細胞增殖、凋亡、侵襲遷移等能力的影響,為前列腺癌的基因治療奠定基礎。目的:探討轉錄因子RUNX3對前列腺癌細胞PC-3增殖、凋亡、侵襲、遷移等細胞學行為的影響。方法:構建重組復制缺陷型腺病毒p Ad-RUNX3,再感染PC-3細胞,western blot檢測RUNX3的表達,間接免疫熒光分析其亞細胞定位;MTT法、平板克隆形成實驗觀察RUNX3對PC-3細胞株的生長抑制作用;Annexin-V染色流式細胞術檢測RUNX3對PC-3細胞凋亡的誘導作用;Transwell小室實驗分析其對PC-3細胞侵襲、遷移的抑制作用。結果:經酶切、PCR及測序鑒定證實成功構建包含RUNX3的重組復制缺陷型腺病毒p Ad-RUNX3。感染PC-3前列腺癌細胞36 h后,結果顯示腺病毒介導的RUNX3可在PC-3細胞中表達,其表達定位于細胞核中。腺病毒介導RUNX3可顯著抑制PC-3前列腺癌細胞的體外生長能力及平板克隆形成能力(P0.05),感染PC-3細胞36 h后可檢測到顯著的細胞周期阻滯(P0.05)。25 MOI Ad-RUNX3感染PC-3細胞36 h后可誘導細胞凋亡(P0.05)。Transwell小室實驗分析Ad-RUNX 3過表達24h后對PC-3侵襲及遷移有顯著抑制作用(P0.05)。結論:成功構建出包含RUNX3的重組復制缺陷型腺病毒,通過感染PC-3細胞,證實RUNX3可在PC-3細胞核中表達。體外細胞實驗證實重組腺病毒介導的轉錄因子RUNX3對PC-3細胞的生長、侵襲、遷移均有顯著的抑制作用,并誘導細胞凋亡的發(fā)生。
【學位單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R737.25
【部分圖文】：

種于24孔板（105個/孔）；細胞融合80%時吸出醛固定30min，0.1M PBS沖洗3次，蒸餾水沖：從24孔板內取出細胞爬片，蒸餾水水化10，室溫孵育20min；0.01M PBS沖洗3次，滴CY3偶聯(lián)的兔抗鼠抗體），常溫下避光反應35min，50%甘油封片，再以熒光顯微鏡觀察pShuttle-CMV-RUNX3-flag 的構建和鑒定g 自質粒上酶切下，再連接至雙酶切（No構建出 pShuttle-CMV-RUNX3-flag (見圖 1) 。

第四軍醫(yī)大學博士學位論文RUNX3-flag 的構建和鑒定性化的 pShuttle-CMV- RUNX3-flag 以細菌，進行細菌內同源重組。提取陽性能釋放出大小約 4. 5 kb 的片段(見圖 2)。

PCR鑒定重組腺病毒pAd-RUNX3-flag

本文編號：2827263