第一部分大鼠腎臟內(nèi)不同的Slc26a6表達(dá)引起形成草酸鈣結(jié)晶的差異研究目的:溶質(zhì)相關(guān)載體26基因家族6號蛋白(Solute-linked carrier 26 gene family 6,Slc26a6)主要在腸道和腎臟中表達(dá),它是一種在草酸陰離子轉(zhuǎn)運中至關(guān)重要的多功能陰離子轉(zhuǎn)運蛋白。本部分研究旨在探討腎臟內(nèi)不同Slc26a6蛋白的表達(dá)對腎臟在高草酸環(huán)境下產(chǎn)生結(jié)晶數(shù)量的影響。方法:在臨床上收集由于高草酸尿引起的草酸鈣結(jié)石患者的切除腎臟標(biāo)本作為結(jié)石組,收集腎臟腫瘤或者腎臟結(jié)核患者的切除腎臟標(biāo)本作為對照組。通過Western blot和免疫組織化學(xué)的方式對兩組腎臟的Slc26a6蛋白表達(dá)水平進(jìn)行比較。分別構(gòu)建帶有Slc26a6基因序列的慢病毒(Lentivirus-Slc26a6)和帶有干擾Slc26a6表達(dá)功能的siRNA-Slc26a6序列的慢病毒(Lentivirus-siRNA-Slc26a6)將構(gòu)建完成的病毒通過腎包膜下注射的方式穩(wěn)定感染至大鼠腎臟內(nèi)。通過Westernblot和免疫組織化學(xué)的方式對大鼠腎臟和腸道Slc26a6表達(dá)情況進(jìn)行鑒定。隨后,通過飼喂乙二醇的方式,構(gòu)建高草酸尿大鼠模型。經(jīng)過乙二醇飼喂一個月后,檢測大鼠的高草酸尿情況和腎臟內(nèi)結(jié)晶形成數(shù)量差異。結(jié)果:免疫組織化學(xué)和Western blot分析表明,與對照組相比,結(jié)石形成者在腎臟中具有顯著更高的Slc26a6表達(dá)水平。慢病毒感染后,慢病毒-Slc26a6感染大鼠的尿草酸濃度和結(jié)石形成率顯著增加,而慢病毒-siRNA-Slc26a6感染的大鼠晶體較少。結(jié)論:結(jié)果顯示,腎臟內(nèi)Slc6a6的高表達(dá)水平可能是促成腎結(jié)石形成的原因之一。下調(diào)Slc26a6在腎臟中的表達(dá)可能是預(yù)防或治療腎結(jié)石的潛在治療靶點。第二部分Slc26a6蛋白表達(dá)對大鼠腎小管上皮細(xì)胞功能的影響目的:本部分旨在研究腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)Slc26a6表達(dá)差異對草酸鹽誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化和晶體形成的影響。方法:分別構(gòu)建帶有Slc26a6基因序列的慢病毒(Lentivirus-Slc26a6)和帶有干擾Slc26a6表達(dá)功能的siRNA-Slc26a6序列的慢病毒(Lentivirus-siRNA-Slc26a6)通過慢病毒穩(wěn)定感染腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)以上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞中Slc26a6的表達(dá)。通過qPCR、Western blot和免疫熒光的方法對細(xì)胞內(nèi)Slc26a6蛋白表達(dá)進(jìn)行測定。通過CCK8方法檢測細(xì)胞活力,Annexin V/PI流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞凋亡情況,DCFH-DA流式細(xì)胞學(xué)測量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)。檢測丙二醛(Malonaldehyde,MDA)生成。使用光學(xué)顯微鏡觀察晶體粘附情況,并通過透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。隨后利用Lentivirus-siRNA-Slc26a6感染SD大鼠腎臟,通過1.0%乙二醇和0.5%氯化銨飼喂2周后,分別測量不同組內(nèi)大鼠腎臟的超氧化物產(chǎn)生情況、細(xì)胞凋亡情況以及腎臟內(nèi)結(jié)晶產(chǎn)生情況。結(jié)果:在體外研究中,與對照組相比,上調(diào)Slc26a6表達(dá)的NRK-52E細(xì)胞在高草酸鹽環(huán)境下細(xì)胞活力降低更顯著,細(xì)胞凋亡率顯著增加,ROS產(chǎn)生增加,MDA產(chǎn)生增加。下調(diào)Slc26a6表達(dá)的NRK-52E細(xì)胞在暴露高草酸鹽環(huán)境后的晶體粘附和細(xì)胞內(nèi)囊泡明顯少于未感染的對照組。體內(nèi)研究中,感染Lentivirus-siRNA-Slc26a6的大鼠在腎中表現(xiàn)出活性氧生成量、細(xì)胞凋亡和晶體形成均減少。同時NFκB磷酸化增強(qiáng)和OPN的磷酸化增加在病理過程中都起到重要作用。結(jié)論:本部分的研究結(jié)果表明,降低腎臟中Slc26a6的表達(dá)可能是預(yù)防結(jié)石形成的潛在策略。第三部分實驗性高草酸尿大鼠腎臟microRNA的表達(dá)變化目的:全面了解實驗性高草酸尿大鼠形成結(jié)石過程中大鼠腎臟miRNA的表達(dá)變化。方法:采用高通量micro-RNA生物芯片技術(shù),尋找在高草酸尿結(jié)石形成SD大鼠與正常SD大鼠腎臟內(nèi)miRNA表達(dá)譜的差異。通過miRNA數(shù)據(jù)庫,預(yù)測miRNA的靶基因,并通過生物信息學(xué)GO分析和KEGG Pathways分析查找差異miRNA可能的富集功能和信號通路,并最終根據(jù)差異miRNA和預(yù)測靶基因構(gòu)建miRNA-靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果:進(jìn)行芯片分析以評估實驗造模和對照組的腎組織中miRNA的表達(dá)差異,選擇組間表達(dá)2倍或0.5倍的miRNA進(jìn)行差異篩選。采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)分析驗證芯片分析結(jié)果。為了預(yù)測miRNA在病理生理過程中的潛在作用,進(jìn)行了GO分析、KEGG Pathway分析和靶基因預(yù)測。觀察到總共28個miRNA在實驗造模組和對照組之間顯著差異表達(dá)(2倍)。在這些miRNA中,有20個被顯著上調(diào),另外8個被顯著下調(diào)。GO和Pathway分析顯示這些miRNA的變化可能與PI3K/AKT等信號通路的激活有關(guān)。結(jié)論:本部分發(fā)現(xiàn)多種miRNA的表達(dá)在乙二醇誘導(dǎo)的高草酸尿癥大鼠的腎組織中發(fā)生改變。生物信息學(xué)的方法預(yù)測了多個與上述miRNA相關(guān)的細(xì)胞功能和信號通路。高草酸尿發(fā)病的潛在機(jī)制可能是miRNA對其靶基因表達(dá)調(diào)控所致。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R691.4
【部分圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文22圖1 通過以上方法，將Slc26a6序列插入慢病毒載體中成為pWSLV-05-Slc26a6（以下簡稱lv-Slc26a6）。 將ds-siRNA抗-Slc26a6序列插入慢病毒載體中成為pLenti-siRNA（Slc26a6）-RFP（以下簡稱lv-siRNA-Slc26a6）。4. 實驗方法4.1 患者標(biāo)本收集1) 收集因草酸鈣結(jié)石而嚴(yán)重腎積水需要腎切除手術(shù)的患者的腎臟皮髓交界處標(biāo)本10 例，作為結(jié)石組；收集患者 24 小時尿液。2) 收集因腎腫瘤或腎結(jié)核而需要切腎的患者的遠(yuǎn)離病灶的正常皮髓交界處組織 10例，作為對照組。收集對照組 24 小時尿液。4.2 患者 24 小時尿液草酸濃度分析1) 配制離子色譜儀的 10 ppM 陰離子標(biāo)準(zhǔn)液試劑 質(zhì)量草酸 0.01 g枸櫞酸 0.01 g磷酸二氫鉀 0.014 g純水 1.0 L2) 配制濃度為 0.5 ppM、1.0 ppM、2.0 ppM、5 ppM、10 ppM 的標(biāo)準(zhǔn)液。3) 通過離子色譜儀將標(biāo)準(zhǔn)液由 0.2 μM 微孔濾膜注入樣品孔內(nèi)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4) 將 24h 尿液標(biāo)本，用 1% 的濃鹽酸進(jìn)行酸化，用 0.3 mM 硼酸溶液稀釋尿液溶液。透過微孔過濾注入色譜儀內(nèi)。

結(jié)石患者與對照組的尿草酸濃度比較。如圖所示，結(jié)石尿草酸濃度顯著高于對照組。組患者的腎臟進(jìn)行 Western blot 分析，結(jié)果如圖 2-2 所示水平高于非結(jié)石組患者。

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文圖 2-2. 草酸鈣結(jié)石患者與對照組的腎臟內(nèi) SLC26A6 表達(dá)水平的 Western blot 分析比較。如圖（A）所示：結(jié)石組患者的腎臟內(nèi) SLC26A6 表達(dá)水平高于對照組。（B）為SLC26A6/β-actin 的相對表達(dá)水平的柱狀圖。通過對兩組患者的腎臟切片進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果如圖 2-3 所示，結(jié)石組腎臟的 Slc26a6 表達(dá)陽性水平高于非結(jié)石組患者。

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2 葉敏;陳達(dá)柔;陳宇中;杜少冰;杜展鑫;李玉鳳;唐s鉈

本文編號：2827191