膀胱癌(UBC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,在美國男性癌癥相關(guān)死亡率中排名第八,2017年男性預(yù)計死亡人數(shù)為12240人。低級別非肌肉侵襲性腫瘤占新診斷膀胱癌病例的75%,其中15-20%的患者會進(jìn)展為肌肉侵襲性膀胱癌(MIBCS;≥T2期)。然而,肌肉侵襲性膀胱癌會發(fā)生轉(zhuǎn)移,患者預(yù)后5年生存率50%。因此,研究膀胱癌病人侵襲和轉(zhuǎn)移的原因是具有重要意義的。Wnt家族由19種分泌的糖蛋白組成,在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞命運(yùn)等過程中發(fā)揮重要作用。Wnt與Frizzleds(Fzds)的七個跨膜蛋白家族成員及其相關(guān)的共受體結(jié)合,刺激下游復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò),這些網(wǎng)絡(luò)依賴于β-catenin(經(jīng)典通路),或者不依賴于β-catenin(非經(jīng)典通路)。盡管在各種癌癥中檢測到Wnt信號通路的頻繁突變,但是除了關(guān)于Wnt相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性與膀胱癌風(fēng)險的關(guān)聯(lián)報道之外,在膀胱癌中Wnt信號通路的體細(xì)胞突變還鮮少報道。之前有報道稱,在小鼠尿路上皮細(xì)胞中,Wnt和AKT途徑同時激活,協(xié)同導(dǎo)致了膀胱癌的形成,這表明Wnt通路在膀胱癌發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用。不過目前尚不清楚Wnt通路中哪些成分可能在膀胱癌侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。在本文的研究中,我們使用人膀朧癌5637細(xì)胞株,從中篩選出了具有低侵襲能力(5637NMI)和高侵襲能力(5637HMI)的兩株細(xì)胞。質(zhì)譜分析顯示,Wnt7a在高侵襲能力(5637 HMI)細(xì)胞中的表達(dá)高于低侵襲能力(5637NMI)細(xì)胞。同時我們還發(fā)現(xiàn),Wnt7a表達(dá)升高與膀胱癌轉(zhuǎn)移和膀胱癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。于是,我們在5637 HMI和T24細(xì)胞中敲降了 Wnt7a,結(jié)果顯示在細(xì)胞中敲降Wnt7a降低了膀胱癌細(xì)胞的侵襲和β-catenin表達(dá)水平,并降低了參與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解的下游靶基因水平。隨后我們用Wnt7a重組蛋白處理5637NMI和J82膀胱癌細(xì)胞株后,提高了細(xì)胞侵襲、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)基因的表達(dá)。TOP/FOPflash熒光素酶實驗分析表明,Wnt7a激活了膀胱癌細(xì)胞中經(jīng)典的β-catenin信號通路,且Wnt7a表達(dá)量增加與UBC樣本中的β-catenin核信號增加有關(guān)。除此之外,我們發(fā)現(xiàn)敲降Wnt7a抑制基質(zhì)金屬蛋白酶10(MMP10)的表達(dá),Wnt7a過表達(dá)通過TCF/LEF兩個啟動子位點(diǎn)激活MMP10啟動子活性,這兩種現(xiàn)象證實Wnt7a通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin途徑介導(dǎo)MMP10激活。最后,我們在臨床樣本中證實,相比與癌旁正常組織,膀胱癌組織中Wnt7a的mRNA和蛋白水平都顯著升高,并且TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示,Wnt7a表達(dá)量高的膀胱癌患者總生存率顯著低于Wnt7a表達(dá)量低的患者。我們證實在侵襲階段早期,尿路上皮切片中細(xì)胞質(zhì)的Wnt7a染色較弱,β-catenin膜信號染色較強(qiáng),而在侵襲性膀胱癌切片中細(xì)胞質(zhì)的Wnt7a染色較強(qiáng),β-catenin核信號染色較強(qiáng),這說明在膀胱癌樣本中Wnt7a過表達(dá)與Wnt/β-catenin信號通路激活是有相關(guān)性的。此外,與正常組織相比,膀胱癌組織中MMP10的mRNA水平顯著升高,并且MMP10也與Wnt7a的的mRNA水平呈正相關(guān)。綜上所述,我們的實驗結(jié)果確立了一條通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號控制UBC侵襲的軸,這可能會給臨床患者的治療和預(yù)后提供參考。
【學(xué)位單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R737.14
【部分圖文】：

。雜，種類眾多，常見的有Ｗｎｔ／ＪＮＫ通路、Ｗｎｔ／Ｃａ２＋通路等。對于號通路的研究，近年來開始逐漸增多。Ｗｎｔ／ＪＮＫ通路又稱平面細(xì)ａｒ－ｃｅｌｌ邋ｐｏｌａｒｉｔｙ，ＰＣＰ）途徑，它是由邋Ｆｒｉｚｚｌｅｄ邋（Ｆｚｄ）激活，與經(jīng)典路在Ｄｓｈ階段分支，通過Ｄｓｈ連接下游的效應(yīng)分子，包括ＧＴＰ酶ｏ相關(guān)激酶（Ｒｈｏ邋ａｎｄ邋Ｒｈｏ邋ｒｅｌａｔｅｄ邋ｋｉｎａｓｅ，ＲＯＣＫ）。該通路參與了不架重排和ｃ－ｊｕｎ氨基末端激酶（ｃ－ＪｕｎＮ－ｔｅｎｎｉｎａｌｋｉｎａｓｅ，ＪＮＫ）以胞板上細(xì)胞的極性作用，可以階段性調(diào)控胚胎發(fā)育［１８］。在Ｗｎｔ／Ｃａ２＋ｎｔ信號引起了細(xì)胞內(nèi)Ｃａ２＋水平增加，再通過鈣依賴性激酶、鈣調(diào)子ＮＦ－ＡＴ發(fā)揮生理效應(yīng)，并且該途徑還可以抑制Ｗｎｔ／（３－ｃａｔｅｎｉｎ通卩－ｃａｔｅｎｉｎ的表達(dá)降低｜７１。Ｃａ２＋敏感信號也可激活蛋白激酶Ｃ邋（ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑Ｃ，邋ＰＫＣ），邋ＰＫＣ作用于細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子，同時也能激活細(xì)胞質(zhì)與生化反應(yīng)，進(jìn)而通過參與基因表達(dá)調(diào)控而影響細(xì)胞的生長和分化ＰＰＯＲＣＮ邋ＭＭｂＭｏｒ逡逑

為了探討ＵＢＣ細(xì)胞侵襲的機(jī)制，我們通過反復(fù)Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ篩選，從５６３７邋ＵＢＣ逡逑細(xì)胞系中分離出了具有低侵襲能力（５６３７邋ＮＭＩ）和高侵襲能力（５６３７邋ＨＭＩ）的逡逑兩株細(xì)胞。如圖２．１Ａ所示，５６３７細(xì)胞未能或成功侵入Ｍａｔｒｉｇｅｌ包被的Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ逡逑Ａ邐Ｃ逡逑ＮＭＩ邐ｔｕｐＭｔ邐ＮＭＩ邐邐邋邐６ｔ３７邐邐邋邐逡逑（ＰＩ）邐ＣｏＩＩｋｉｍｍ邐（ｆ？１２）邐＿邐ＷＨＪ邐ｐｆＸｌＷＣＨＴ邐ＨＭＩ邋＿逡逑Ｗ７ＮＭＩ邋ｃｎ％邋？邋８Ｍ７邋ＨＭＩ邋ｃ？ｌｈ邋Ｏ邋ｍ0ｆｗ＾ｄｆ？ｅ？ｙ邋＞？ｖｓ＊ｖ邋Ｓ６Ｉ７邋＜？ｌｈ￣｜逡逑ＮＭＩ邐ｐａｒｅｎｔａｌ邋ｅｖｉｌｓ邐ＨＭＩ邐＿逡逑＿姦１１１＿＿逡逑＊°＊１邐…邐１２0１邋￣￣５６３７邋ＮＭＩ邐…逡逑１邐￣￣邐５－１００－邋。》Ｊ７邋ｐ＊ｒ？？ＵＩ邐＿１＾＿逡逑Ｉ邋？00邐邐Ｃ邐５Ｍ７邋ＭＭ？逡逑＼邐ｒ＾ｉ邐ｉｓ邋￣邐．．．邐—逡逑ｉ邋４００邐－邐｜！邋？■邋￣２Ｚ邐ｒｉ逡逑］？0邐ｉｆｗ．二門逡逑＇Ｊｒ＾ｒｎ邋Ｐ＾￣ｌ邋Ｌ—１．

膀胱癌轉(zhuǎn)移分子機(jī)制研宄逡逑ＵＢＣ中的作用仍不清楚［１５（）１，因此我們首先分析了其在ＵＢＣ樣本中的表達(dá)水平。逡逑如圖２．３Ａ所示，與癌旁正常組織相比，ＵＢＣ樣本（ｎ＝４１）的ｗｎｔ７ａｍＲＮＡ水平逡逑平均增加了邋２．０８倍。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，ＵＢＣ組織中的逡逑Ｗｎｔ７ａ蛋白水平顯著增加（ｎ＝２０，邋ｐ＝０．０３３９；圖２．３Ｂ和２．３Ｃ）。使用來自公共數(shù)逡逑據(jù)集（ＴＣＧＡ，臨時）的獨(dú)立數(shù)據(jù)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性病變（Ｎ０）的ＵＢＣ的Ｗｎｔ７ａ逡逑ｍＲＮＡ水平比正常膀胱組織高７．２倍，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性病變（２Ｎ１）的ＵＢＣ逡逑甚至比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性病變的ＵＢＣ高１．６２倍（ｐ＜０．０５；圖２．３Ｄ）。而且，與正逡逑常膀胱組織相比，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶（Ｍ０）的ＵＢＣ中Ｗｎｔ７ａ的ｍＲＮＡ水平高出７．５８逡逑倍。有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶（Ｍｌ）的ＵＢＣ比無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶（Ｍ０）的ＵＢＣ高２．４４倍（ｐ＜０．０５；逡逑圖２．３Ｅ）。值得注意的是，在ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫的兩列中，Ｗｎｔ７ａｍＲＮＡ水平高的逡逑Ａ邐Ｂ邐Ｃ逡逑°１邋ｐ－０．０１３１邐１２邐３邐４邐Ｓ邐？邐７邐？邐？邐１０逡逑ＩＮＴＮＴ邋ＷＴ邋Ｎ邋Ｔ邋Ｎ邋Ｔ邋Ｗ邋Ｔ邋Ｎ邋Ｔ邋Ｈ邋Ｊ邋￣Ｈ￣Ｊ邋Ｎ邋Ｔ邐１Ｓ邐ｐ－０．０３３９逡逑Ｗｎｔ７———邋一邐｜邐

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