發(fā)布時間：2020-09-19 18:04

　　 目的:腎間質炎癥纖維化是多種慢性腎病進展為終末期腎病的共同病變過程和病理基礎,其發(fā)病機制迄今尚未闡明,通常認為是多因素綜合作用的結果,其中細胞死亡對炎癥反應及后續(xù)纖維化發(fā)揮關鍵作用。壞死性凋亡是一種新型的細胞死亡模式,它具有細胞質膜崩解、細胞器腫脹和線粒體功能喪失等細胞壞死的主要特征,同時又是一種可調控的,caspase非依賴的程序性細胞死亡。大量研究顯示壞死性凋亡能誘發(fā)、驅動炎癥反應。壞死性凋亡在急性胰腺炎、缺血性損傷、神經(jīng)退行性變等小鼠模型,以及臨床克羅恩病中發(fā)揮重要作用。此外,壞死性凋亡在多種腎臟疾病,如順鉑誘導的腎損傷、腎缺血再灌注、腎移植以及腎大部切除大鼠慢性腎纖維化等多種動物模型中也起到關鍵作用。在本研究中,我們應用單側輸尿管結扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)建立腎間質炎癥纖維化模型,檢測小鼠UUO模型中是否存在壞死性凋亡,然后應用壞死性凋亡特異性抑制劑necrostatins-1(Nec-1)進行干預,檢測梗阻腎臟中炎癥和纖維化分子指標表達情況,旨在探討抑制壞死性凋亡的腎臟保護作用及可能機制,為臨床腎病的治療提供新思路。方法:1.動物模型建立健康雄性C57BL/6J小鼠按隨機區(qū)間法分為假手術組(Sham,n=6)、左側輸尿管結扎組(UUO,n=6)、輸尿管結扎后經(jīng)Nec-1治療組(UUO+Nec-1,n=6)。UUO+Nec-1組自手術日起,每天給予Nec-1(1mg/kg/day)腹腔注射治療。Sham組除不結扎輸尿管外同模型組做相同處理。2.腎組織取材和指標檢測術后7天處死小鼠,留取腎組織于4%多聚甲醛溶液中固定,用于常規(guī)病理學染色、免疫組織化學檢測;剩余腎組織經(jīng)液氮速凍,用于提取腎皮質總蛋白和總RNA。免疫組織化學和Western blot檢測受體相互作用蛋白1(receptor interacting protein 1,RIP1)、受體相互作用蛋白3(receptorinteracting protein 3,RIP3)、混合譜系激酶結構域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-lβ(Interleukin-1β,IL-1β)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、轉化生長因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、α型肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型膠原(collagen I,Col 1)的蛋白表達,熒光實時定量PCR檢測RIP1、RIP3、MLKL、TNF-α、IL-1β、MCP-1、TGF-β1、α-SMA、Col 1的基因表達。結果:1.Nec-1改善了UUO引起的腎臟病理損傷HE染色顯示,Sham組腎小管結構正常,腎間質未見明顯炎細胞增生。UUO組可見單核與淋巴細胞浸潤明顯,部分近曲小管水腫或萎縮,部分腎小管明顯擴張,管腔內可見壞死脫落的上皮細胞。Nec-1治療后腎間質炎性浸潤減少,腎小管上皮細胞腫脹、擴張和壞死程度減輕。Masson染色顯示,UUO組腎間質有大量膠原纖維沉積,Nec-1治療明顯減輕了纖維化程度。2.Nec-1降低了UUO引起的壞死性凋亡相關標志物表達的升高免疫組織化學檢測結果顯示,Sham組RIP1在遠曲小管胞漿中有少量表達,RIP3和MLKL在小管胞漿中有微量表達。UUO組RIP1在大量遠曲小管上皮細胞胞漿和胞核中都有表達,RIP3多于近曲小管胞漿中呈強陽性,而MLKL在部分小管細胞胞漿中大量表達,部分小管胞核也有表達。Nec-1干預后,RIP1、RIP3和MLKL的陽性信號均明顯減弱。Western blot和熒光實時定量PCR檢測結果顯示,UUO腎組織中RIP1、RIP3、MLKL蛋白及mRNA表達較Sham組顯著升高,給予Nec-1治療后,RIP1、RIP3、MLKL蛋白質和mRNA水平明顯降低。3.Nec-1減少了UUO小鼠腎臟中炎癥因子的表達免疫組織化學結果顯示,Sham組炎癥相關因子IL-1β、MCP-1于腎小管胞質中有少量表達,UUO組腎小管胞質中二者表達顯著上調,UUO+Nec-1組IL-1β和MCP-1在腎小管中的陽性表達明顯降低。Western blot和熒光實時定量PCR檢測結果顯示,UUO組腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1蛋白質及mRAN表達相較Sham組明顯上升,給予Nec-1治療后,三種炎癥因子的蛋白質及mRAN水平顯著下調。4.Nec-1減輕了UUO小鼠腎臟間質纖維化程度免疫組織化學檢測顯示,在Sham組腎間質中,Col 1、TGF-β1有微量表達,α-SMA僅表達于動脈中層平滑肌細胞中。UUO組,Col 1在間質內表達量顯著增加,α-SMA除表達于血管平滑肌外,還大量表達于腎間質和腎小管上皮細胞中,TGF-β1在腎小管胞漿中大量表達。UUO+Nec-1組Col 1、α-SMA和TGF-β1的陽性表達明顯減弱。Western blot和Real-time PCR檢測結果顯示,UUO組腎組織中Col 1、α-SMA和TGF-β1蛋白和mRNA水平均較Sham組顯著升高,應用Nec-1治療后,Col 1、α-SMA和TGF-β1蛋白和mRNA表達量明顯下降。結論:1.壞死性凋亡在單側輸尿管結扎腎臟病理改變中起重要作用。2.壞死性凋亡特異性抑制劑Nec-1的腎臟保護作用可能是部分通過抑制炎癥和纖維化實現(xiàn)的。
【學位單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R692
【部分圖文】：

21圖 1 腎組織 HE 染色Fig. 1 HE staining of renal tissue (×400)am group B: UUO group C: UUO+Nec-1

圖 2 腎組織 Masson 染色Fig. 2 Masson staining of renal tissue (×400)A: Sham group. B: UUO group. C: UUO+Nec-1 group. D: Statistical analysisfor the percentage of renal fibrotic area.**P<0.01 vs. Sham group,##P<0.01 vs.UUO group.

23 3 各組小鼠腎組織 RIP1 免疫組化染色結nohistochemical staining for RIP1 in renal am group B: UUO group C: UUO+Nec-

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本文編號：2822837