研究背景:IgA腎病(IgA nephropathy,IgAN)是由法國病理學(xué)家Berger和Hinglais于1968年發(fā)表在d’Urologie et Néphrologie雜志上,所以IgAN又被稱為Berger病。后來,它被證明是全球范圍內(nèi)人類原發(fā)性腎小球腎炎最常見的類型,也是我國終末期腎臟病的主要原因,現(xiàn)在發(fā)病呈逐年上升趨勢。IgAN的確診主要依賴于腎臟病理活檢,鏡下主要特征為:腎小球系膜區(qū)IgA或以IgA為主的免疫復(fù)合物沉積,同時(shí)可能伴有不同程度的系膜細(xì)胞的增殖和基質(zhì)的堆積。據(jù)最新的研究顯示:亞洲地區(qū)腎活檢IgAN的檢出率約50%,而我國IgAN的發(fā)病率高達(dá)45%。在大多數(shù)情況下,IgAN患者約10-30%在10年內(nèi)可進(jìn)展為腎功能衰竭(End-stage renal disease,ESRD)。因其主要累及青年人,給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。但目前IgAN發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,因此對IgAN發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討是非常必要的。既往一系列研究及我們的前期結(jié)論均顯示:粘膜免疫及其重要的效應(yīng)蛋白-分泌型IgA(Secretory IgA,SIgA)在IgAN發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。IgAN患者常在上呼吸道或腸道等粘膜感染后發(fā)生肉眼血尿和/或蛋白尿。全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide association studies,GWAS)結(jié)果顯示IgAN風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的大多數(shù)基因組也與粘膜免疫有關(guān);且粘膜相關(guān)抗原免疫小鼠可誘導(dǎo)IgAN動物模型;逐漸增多的針對粘膜免疫的治療應(yīng)用于IgAN也得到了一定的療效,SIgA是參與人體粘膜免疫的最重要抗體,其主要由粘膜淋巴組織B細(xì)胞產(chǎn)生,主要分布在口腔、腸道消化液、呼吸道粘膜以及初乳中,部分反流入血。我們前期研究探討了SIgA在IgAN中的作用,發(fā)現(xiàn)IgAN患者血清和尿液中的SIgA水平與臨床表現(xiàn)、腎臟損傷相關(guān);約1/3患者腎組織中有SIgA的沉積,且IgAN患者的SIgA具有致病性,可致使HRMC增殖、活化從而參與腎臟的損傷。近年來的研究結(jié)果提示,與粘膜免疫相關(guān)的Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)尤其是TLR4可能參與了IgAN的發(fā)病。TLRs是參與固有免疫的一類重要蛋白分子,在粘膜組織識別微生物和觸發(fā)抗感染免疫反應(yīng)的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。IgAN患者外周血單個核細(xì)胞TLR4的表達(dá)及其m RNA轉(zhuǎn)錄水平均明顯升高,且與患者血尿及尿蛋白密切相關(guān);IgAN患者腭扁桃體及腎組織中TLR4高表達(dá)且與患者IgA1含量及其糖基化缺失相關(guān),其可能通過促進(jìn)促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生,從而參與系膜細(xì)胞的損傷;羥氯喹通過降低TLR4的表達(dá),可有效降低IgAN患者的蛋白尿。因此我們從粘膜免疫新角度對IgAN發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討是非常必要的。研究目的:探討SIgA和TLR4之間能否相互作用,從而介導(dǎo)IgAN患者腎臟的損傷。研究方法:選取我院腎內(nèi)科在2016年09月-2017年09月期間住院患者,經(jīng)腎臟病理活檢確診為原發(fā)性IgAN,共87例。所有病例的穿刺腎小球數(shù)≥10個,均除外糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗GBM病、慢性肝病等引起繼發(fā)性IgAN。(1)免疫熒光的方法檢測IgAN患者腎組織切片中SIgA的沉積情況;(2)免疫組化的方法檢測SIgA沉積陽性和陰性的IgAN患者腎組織切片中TLR4,My D88和NF-κB的表達(dá)差異;(3)收集SIgA沉積陽性的IgAN患者唾液和年齡性別相匹配的健康志愿者唾液,親和層析技術(shù)從唾液中提純分泌型IgA,分別為P-SIgA和N-SIgA;(4)結(jié)合實(shí)驗(yàn):體外培養(yǎng)人腎系膜細(xì)胞(Human renal mesangial cell,HRMC),流式細(xì)胞術(shù)檢測SIgA和HRMC的結(jié)合情況;(5)刺激實(shí)驗(yàn):并分別用400μg/ml的P-SIgA、N-SIgA和PBS(陰性對照)刺激HRMC 24h,收集細(xì)胞上清,提取細(xì)胞蛋白和總RNA,通過Western blot、ELISA和RT-PCR方法檢測HRMC中TLR4、My D88、NF-κB和炎癥因子TNF-α、IL-6和MCP-1的表達(dá)和分泌。研究結(jié)果:1.約30%的IgAN患者腎組織中腎小球系膜區(qū)有SIgA的沉積;2.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:P-SIgA與HRMC結(jié)合率約85%,顯著高于N-SIgA與HRMC的結(jié)合率;3.P-SIgA刺激后的HRMC,在蛋白和基因表達(dá)水平TLR4、My D88、NF-κB和炎癥因子TNF-α、IL-6和MCP-1高于N-SIgA組;4.SIgA沉積陽性的IgAN患者腎組織中TLR4、My D88和NF-κB以及細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和MCP-1的表達(dá)均明顯強(qiáng)于正常對照組和MCD疾病對照組。研究結(jié)論:SIgA可能通過與HRMC結(jié)合沉積于系膜區(qū),從而誘導(dǎo)HRMC高表達(dá)TLR4,進(jìn)一步激活下游信號通路,導(dǎo)致炎癥因子TNF-α、IL-6和MCP-1的產(chǎn)生,進(jìn)一步導(dǎo)致IgAN的腎臟損傷。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R692.31
【部分圖文】：

第三章 結(jié)果3.1 腎小球 SIgA 沉積檢測經(jīng)過腎組織的 SIgA 免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)：紅色為 IgA 的 SC 分泌片段，表達(dá)在系膜區(qū)，少量的在腎小管表達(dá)，綠色的 IgA 均沿系膜區(qū)分布。共檢測了 87 名IgAN 患者，其中 28 名可見到系膜區(qū) SC 與 IgA 的共沉淀，既 SIgA，顯色為黃色，占 31%（圖 3.1）。陰性對照只見 IgA 沿系膜區(qū)分布，未見紅色 SC 的沉積。

圖 3.2 通路蛋白 TLR4、MyD88 和 NF-κB 在腎組織的沉積（A,B）：TLR4 分別在正常人、SIgA 沉積陽性 IgAN 患者腎臟的表達(dá)；（C,D）：MyD88分別在正常人、SIgA 沉積陽性 IgAN 患者腎臟的表達(dá)；（E,F）：NF-κB 分別在正常人、SIgA沉積陽性 IgAN 患者腎臟的表達(dá)。放大倍數(shù)：400×3.3 唾液 SIgA 的提純結(jié)果經(jīng)過 Jacalin 層析柱提純后，其中：A 峰為穿過峰，為未與 Jacalin 結(jié)合的蛋白；B 峰為洗脫峰，既經(jīng)蜜二糖洗脫下來的 SIgA（圖 3.3）。

圖 3.3 唾液 SIgA 的 Jacalin 親和柱色譜圖3.4 提純 SIgA 的鑒定結(jié)果不論從 IgAN 患者還是志愿者唾液經(jīng) Jacalin 純化的 SIgA，經(jīng)過 SDS-蛋白泳分為 3 個條帶：SC（75kDa）、IgA 重鏈（56kDa）和 IgA 輕鏈（23kDa）同商品化 SIgA 位置基本一致，且無雜帶（圖 3.2A）；經(jīng) Western blot 檢測更一步驗(yàn)證了 SC（圖 3.4 B）和 IgA（圖 3.4 C）。

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本文編號：2821843