目的:腎癌是泌尿系最常見的惡性腫瘤之一,預后差,目前其發(fā)生、發(fā)展的分子機制尚未完全明確。微小RNA(miRNAs)是一類小分子非編碼RNA,作為近期的研究熱點之一,其已被證實在多種人類惡性腫瘤的生物學進程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。有報道指出miR-660-5p是高度保守的miRNA,在肺癌、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、白血病等多種腫瘤中表達異常,并可通過調(diào)控細胞增殖、遷移、侵襲力和凋亡的改變而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而目前miR-660-5p在腎癌中的功能及作用的分子機制尚未明確,亦未有相關研究證實。因此本課題研究通過在腎癌組織中檢測miR-660-5p的表達,并通過體外細胞實驗探究其功能,進一步探索其作為腎癌生物標記物應用于臨床的可能性。方法:通過基因芯片研究結(jié)果,篩選出腎癌組織中低表達的miR-660-5p,通過RT-qPCR方法檢測其在25對腎癌及癌旁正常組織中的表達。采用四格表行?~2檢驗探究miR-660-5p表達水平與患者臨床特征之間的關系。為探究其功能,在腎癌細胞(786-O和ACHN)轉(zhuǎn)染miR-660-5p功能類似物或抑制劑以過表達或敲低其表達,通過劃痕實驗驗證miR-660-5p對腎癌細胞遷移的影響,MTT和CCK-8實驗驗證其對腎癌細胞增殖的影響,Transwell實驗驗證其對腎癌細胞遷移和侵襲的影響,流式細胞術(shù)驗證其對腎癌細胞凋亡的影響。結(jié)果:RT-qPCR結(jié)果顯示25對腎癌組織及癌旁正常組織中,有18對(72%)表達下調(diào),癌旁正常組織的表達量為腎癌組織的3.44±0.375倍,提示腎癌組織表達量明顯低于癌旁正常組織(p0.01)。miR-660-5p的表達水平與患者臨床特征之間無明顯差異(P0.05),未見明顯相關性。與對照組相比,在786-O和ACHN細胞中轉(zhuǎn)染miR-660-5p inhibitor后,其表達水平分別是對照組的0.13±0.029和0.01±0.00309倍。而轉(zhuǎn)染miR-660-5p mimic后,其表達水平分別是對照組的1762.10±261.812和590.19±112.202倍(P0.05)。細胞功能實驗結(jié)果中,與陰性對照組相比,劃痕實驗結(jié)果表明過表達miR-660-5p可抑制腎癌細胞遷移,敲低表達則促進細胞遷移;MTT和CCK-8實驗結(jié)果表明過表達miR-660-5p可抑制腎癌細胞增殖,敲低則促進細胞增殖;Transwell實驗表明過表達可抑制腎癌細胞遷移和侵襲,敲低則促進細胞遷移和侵襲;流式細胞術(shù)實驗表明過表達可誘導腎癌細胞凋亡,敲低則抑制細胞凋亡。結(jié)論:miR-660-5p在腎癌組織中顯著低表達,上調(diào)miR-660-5p可抑制腎癌細胞的遷移、侵襲和增殖能力,并誘導細胞凋亡,而下調(diào)miR-660-5p則促進腎癌細胞遷移、侵襲和增殖,并抑制細胞凋亡。以上結(jié)果表明,miR-660-5p在腎癌組織中異常表達,發(fā)揮著抑癌基因的作用,并參與調(diào)控腎癌細胞的生物學功能,有望成為腎癌早期診斷和治療的新生腫瘤標志物。
【學位單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737.11
【部分圖文】：

圖 1：生物信息軟件預測 miR-660-5p 的靶基因（GALNT7）以及互補位點（圖中下劃線部分）綜上所述，本課題實驗從分子及基因?qū)W水平闡述腎癌的發(fā)生發(fā)展機制，并尋找腎癌早期診斷及術(shù)后監(jiān)測的腫瘤標志物和潛在的治療靶點，對腎癌的診斷和治

圖2.miR-660-5p在25對腎癌組織及癌旁正常組織的表達水平。圖2A. 腎癌組織中miR-660-5p 與配對的癌旁正常組織表達量比值經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后結(jié)果；圖 2B. 腎癌組織與癌旁正常組織中的相對表達量，腎癌組織表達量明顯低于癌旁正常組織（P<0.01）圖 2C.miR-660-5p在轉(zhuǎn)染至 ACHN 和 786-O 腎癌細胞的表達水平（P<0.05）。(miR, 微小 RNA; NAT, 癌旁正

癌旁正常組織的表達量為腎癌組織的 3.44 0.375 倍，提示腎癌組織表達量明顯低于癌旁正常組織（P<0.01）。圖2.miR-660-5p在25對腎癌組織及癌旁正常組織的表達水平。圖2A. 腎癌組織中miR-660-5p 與配對的癌旁正常組織表達量比值經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后結(jié)果；圖 2B. 腎癌組織與癌旁正常組織中的相對表達量，腎癌組織表達量明顯低于癌旁正常組織（P<0.01）圖 2C.miR-660-5p在轉(zhuǎn)染至 ACHN 和 786-O 腎癌細胞的表達水平（P<0.05）。(miR, 微小 RNA; NAT, 癌旁正常組織; NC, 陰性對照; RCC, 腎細胞癌。)Figure 2. Expression of miR-660-5p in 25 paired RCC tissues and NATs. (A) Log2 ratios(RCC/NAT) of miR-660-5p expression in 25 paired tissues. (B) The relative expression of miR-660-5p in RCC and NATs. (C) The expression of miR-660-5p inACHN and 786-O cells followingtransfection. *P<0.05; **P<0.01. miR, microRNA; NAT, normal adjacent tissue; NC, negativecontrol; RCC, renal cell carcinoma.2 miR-660-5p 表達水平與患者臨床病理特征 間無明顯相關性將病例按 miR-660-5p 相對表達量平均數(shù)-1.7862 分為界分高表達組和低表達組，其中高表達組 12 例，低表達組 13 例。按照患者年齡（年齡以中位數(shù) 52 歲分界）、性別、病理組織學分型、臨床分期分組，通過建立四格表進行 2檢驗，探究 miR-660-5p 表達水平與患者臨床特征之間的關系，結(jié)果如表 5 所示，未發(fā)現(xiàn) miR-660-5p 表達水平與病例相關臨床特征之間的關系（p>0.05）

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