【目的】單純的去細(xì)胞生物支架存在脆性增強(qiáng)、成形能力差、易降解等不足,往往需要經(jīng)過交聯(lián)反應(yīng)改善支架的各項(xiàng)生物性能,本研究的主要目的是通過浸泡交聯(lián)法制備京尼平交聯(lián)改性去細(xì)胞全腎支架,以改善去細(xì)胞腎支架的降解時間、抗炎及生物力學(xué)性能,為臨床需要奠定基礎(chǔ)�！痉椒ā拷】礢D大鼠80只,體重為250g左右,隨機(jī)分為正常組、未交聯(lián)支架組、戊二醛交聯(lián)支架組和京尼平交聯(lián)支架組。游離大鼠腎臟、腎動靜脈,連接蠕動泵,將大鼠腎臟經(jīng)PBS灌注去血以后得到的腎臟作為正常組。大鼠腎臟被依次灌入肝素化PBS溶液、1%Triton X-100、1%十二烷基硫酸鈉(SDS)、去離子水,以完成大鼠腎臟去細(xì)胞生物支架制備。戊二醛交聯(lián)支架組繼續(xù)灌入0.625%戊二醛(GA)溶液1500ml,灌注時間為12小時;京尼平交聯(lián)支架組浸入到0.5%的京尼平溶液中37℃恒溫箱中行化學(xué)交聯(lián)24h;未經(jīng)戊二醛和京尼平交聯(lián)的腎臟去細(xì)胞支架作為未交聯(lián)支架組。對四組腎臟分別作HE、Masson、免疫熒光染色鏡檢及電子顯微鏡掃描,觀察支架組織形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變;力學(xué)拉伸試驗(yàn)檢測并對比各組機(jī)械力學(xué)性能;皮下包埋實(shí)驗(yàn)檢測各組支架的抗炎性及抗降解能力;細(xì)胞支架共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測不同交聯(lián)劑對細(xì)胞生長與增殖的影響。【結(jié)果】SD大鼠腎臟支架經(jīng)京尼平交聯(lián)后,HE、Masson染色顯示膠原纖維排列更加緊密有序,腎小球處的纖維聚集,并且膠原蛋白I和膠原蛋白IV熒光染色得到增強(qiáng),電鏡掃描顯示,交聯(lián)后的去細(xì)胞支架的纖維連續(xù)無斷裂,三維空間結(jié)構(gòu)呈蜂窩狀排列,典型的腎小球結(jié)構(gòu)輪廓更加清晰;機(jī)械性能測試顯示交聯(lián)組腎彈性模量較未交聯(lián)支架組明顯增強(qiáng)。皮下包埋實(shí)驗(yàn)表明在移植術(shù)后3天和7天時,炎性細(xì)胞的數(shù)量在京尼平交聯(lián)組顯著低于未交聯(lián)組,并且支架的腎小球輪廓在14天時仍然清晰可見,未被降解,未交聯(lián)支架組以及正常組腎組織中進(jìn)一步被炎性細(xì)胞浸潤,發(fā)生了降解,并與宿主組織界限模糊不清。細(xì)胞支架共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明,各組內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞都能粘附于支架的表面生長,和京尼平交聯(lián)后,腎支架與血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞相容性良好�！窘Y(jié)論】京尼平交聯(lián)大鼠腎支架的交聯(lián)方法簡單易行,并且具有良好的抗炎、抗降解性及生物相容性,使腎臟去細(xì)胞支架的三維空間結(jié)構(gòu)更為飽滿立體,大大提高了支架的生物學(xué)性能,能更好地為后期細(xì)胞植入和器官再生奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R318.08;R692.5
【部分圖文】：

3.1 大體形態(tài)觀測及組織學(xué)和免疫組織化學(xué)鑒定正常對照組大鼠的腎臟為暗紅色，經(jīng)過去細(xì)胞溶液灌注去細(xì)胞后，腎臟顏色由暗紅色變?yōu)橥咙S色，最終變?yōu)榘咨胪该�。腎內(nèi)樹狀脈管分支結(jié)構(gòu)清晰可見，并且保持原有的腎形而略塌陷。經(jīng)戊二醛交聯(lián)后的腎支架變?yōu)榈S色，經(jīng)京尼平交聯(lián)后的腎支架變?yōu)榻邓{(lán)色（圖 1）。HE 染色顯示正常組腎切片內(nèi)可見藍(lán)色的細(xì)胞核以及紅色的細(xì)胞質(zhì)，未交聯(lián)支架組、戊二醛交聯(lián)支架組以及京尼平交聯(lián)支架組腎切片內(nèi)均未見藍(lán)色的細(xì)胞核，腎小球輪廓仍然存在（圖 2），表明去細(xì)胞后SD 大鼠腎組織細(xì)胞核成分被去除。Masson 染色結(jié)果顯示（圖 2），正常組的腎切片內(nèi)可以清楚的看到腎小球和腎小管的形態(tài)。膠原纖維呈淺藍(lán)色和交織成沒有明顯的裂縫的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。經(jīng)京尼平交聯(lián)后的腎小球輪廓明顯比戊二醛組以及未交聯(lián)組清晰，這表明通過京尼平交聯(lián)后腎支架中的膠原纖維更加密集。

圖 2 SD 大鼠腎臟各組 HE 與 Masson 染色,黑色箭頭所指為腎小球Fig.2 HE staining of all the groups of SD rat kidney, the blank arrows pointingglomerulus3.2 免疫熒光結(jié)合 DAPI 染色腎臟細(xì)胞外基質(zhì)主要成分包括一型膠原和四型膠原，一般情況下一型膠原聚集為膠原纖維，交織排列成網(wǎng)，構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)框架；四型膠原主要分布在腎小球和腎小管基底膜以及腎小球系膜區(qū)，主要參與構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障[26]。免疫組織熒光染色顯示 SD 大鼠正常組紅染的一型膠原、綠染的四型膠原以及藍(lán)染的細(xì)胞核，而各支架組僅顯示紅染的一型膠原、綠染的四型膠原，無藍(lán)染細(xì)胞核成分（圖 3），經(jīng)京尼平交聯(lián)的腎去細(xì)胞生物支架熒光染色增強(qiáng)，熒光顯示腎小球的輪廓清晰可見，膠原纖維呈網(wǎng)狀分布，表明去細(xì)胞處理后腎支架內(nèi)的細(xì)胞核成分

圖 3 SD 大鼠腎臟各組 Collagen I、Collagen IV 以及 DAPI 免疫熒光染色，白色箭頭所指為腎小球Fig.3 Immunofluorescence staining of Collagen I、Collagen IV and DAPI in allthe groups of SD rat kidney, the white arrows pointing glomerulus3.3 掃描電鏡檢測電鏡掃描顯示在腎去細(xì)胞生物支架未交聯(lián)組、戊二醛交聯(lián)組和京尼平交聯(lián)組的腎去細(xì)胞生物支架上均沒有細(xì)胞殘留物，并且膠原完全連接而沒有破裂。鏡下可見 SD 大鼠腎臟支架支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)為蜂窩狀結(jié)構(gòu)，清晰地呈現(xiàn)出膠原纖維排列形成的三維立體空間結(jié)構(gòu)以及明顯的腎小球龕樣輪廓結(jié)構(gòu)（剖面，圖 4），經(jīng)京尼平交聯(lián)后的腎小球處的空間結(jié)構(gòu)更為立體，說明交聯(lián)的過程并沒有破壞膠原纖維排列形成的三維空間結(jié)構(gòu)，交聯(lián)后的膠原纖維形成的空間構(gòu)架更為飽滿立體。

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本文編號：2820879