背景近年來,糖尿病發(fā)病率持續(xù)增高,其常見并發(fā)癥糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者中發(fā)生率高達(dá)20%~40%,為社會(huì)造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。然而,DN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,至今仍未徹底闡明。2型DN是典型的基因效應(yīng)與環(huán)境因素相互作用而導(dǎo)致的復(fù)雜性疾病,表觀遺傳學(xué)機(jī)制在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。然而,DN表觀遺傳學(xué)研究仍處于起步階段,目前尚無針對(duì)DN患者腎組織甲基化狀態(tài)改變的研究。因此,本研究擬利用DN患者的腎組織繪制DNA甲基化圖譜,并結(jié)合生物信息學(xué)分析,以探尋在DN發(fā)生過程中出現(xiàn)的特異性甲基化改變和相關(guān)信號(hào)通路,為后續(xù)治療靶點(diǎn)的探尋奠定基礎(chǔ)。目的1.率先繪制2型DN患者腎組織全基因組DNA甲基化圖譜,為后續(xù)人類DN表觀遺傳學(xué)的研究提供依據(jù);2.通過DNA甲基化圖譜的繪制和生物信息學(xué)分析,篩選出數(shù)個(gè)2型DN患者中特有的甲基化差異位點(diǎn),有助于DN治療靶點(diǎn)的探尋,從而為精準(zhǔn)治療和個(gè)體化無創(chuàng)診斷奠定基礎(chǔ)。方法1.標(biāo)本來源:非糖尿病患者7例(癌旁組織)、T2DM患者7例(癌旁組織)、2型DN患者7例(腎穿刺組織)和2型非糖尿病性腎臟疾病(non-diabetic renal disease,NDRD)患者8例(其中膜性腎病3例,Ig A腎病3例和局灶階段性腎小球硬化癥2例,均為腎穿刺組織),診斷標(biāo)準(zhǔn)均為腎臟病理檢查確診;2.全基因組甲基化測(cè)序和甲基化圖譜的繪制:借助Illumina二代高通量測(cè)序平臺(tái)并結(jié)合全基因組重亞硫酸鹽處理技術(shù),完成全基因組甲基化測(cè)序和DNA甲基化圖譜的繪制;3.生物信息學(xué)分析:通過甲基化差異分析和GO、KEGG分析,得到與DN密切相關(guān)的信號(hào)通路,錨定數(shù)個(gè)與DN發(fā)病機(jī)制相關(guān)的基因位點(diǎn)。結(jié)果1.率先完成了DN患者腎組織DNA甲基化圖譜的繪制;2.發(fā)現(xiàn)了DN組和NDRD組之間649個(gè)甲基化差異區(qū)域,在DN組和DM組之間,發(fā)現(xiàn)了609個(gè)甲基化差異區(qū)域;綜合分析后,有160個(gè)甲基化差異區(qū)是DN組既不同于NDRD組又不同于DM組的位點(diǎn);3.結(jié)合甲基化水平差異分析和相關(guān)富集分析,發(fā)現(xiàn)了Hippo信號(hào)通路,泛酸鹽,CoA生物合成,內(nèi)吞作用和細(xì)胞黏附分子等生化代謝通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與DN組的相關(guān)度最高;4.結(jié)合甲基化差異程度和富集程度,進(jìn)一步錨定了7個(gè)排名最高且與DN發(fā)病機(jī)制相關(guān)的基因位點(diǎn):CTGF,MMP-9,MTHFR,let-7a-3,ITGB1,PANK1和Mst1。結(jié)論Hippo信號(hào)通路,泛酸鹽,CoA生物合成,內(nèi)吞作用和細(xì)胞黏附分子等生化代謝通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,CTGF,MMP-9,MTHFR,let-7a-3,ITGB1,PANK1和Mst1基因在DN組中的甲基化差異程度和富集程度排名最高,可能成為未來DN的治療靶點(diǎn)或無創(chuàng)診斷標(biāo)志物。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R587.2;R692.9
【部分圖文】：

2.4.1甲基化WGBS（Whole Genome Bisulfite Sequencing）文庫的構(gòu)建我們用純度，濃度及完整性質(zhì)量均合格的 1ug 基因組 DNA 樣品進(jìn)行起始建，C-T 轉(zhuǎn)化根據(jù) EZ DNAMethylation-Gold Kit DNA 甲基化試劑盒（D5006）法及操作說明進(jìn)行重亞硫酸鹽處理和 WGBS 文庫的構(gòu)建。對(duì)基因組 DNA 用聲波隨機(jī)打斷成長度為 200bp 左右的小片段，然后進(jìn)行末端修復(fù)，加入堿基 A，再加上測(cè)序接頭，隨后將其用重亞硫酸鹽進(jìn)行處理，把未發(fā)生甲基化的胞啶 C 轉(zhuǎn)換為尿嘧啶 U，而發(fā)生甲基化的胞嘧啶 C 則不發(fā)生改變，經(jīng)過篩選后，符合要求的片段進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，具體流程主要包括以下幾個(gè)內(nèi)容：（1））DNA 片段化（Fragment DNA）；（2）末端修復(fù)（End Repair）；（3）末端加“A”（A-Tailing）；（4）甲基化接頭連接（Ligate MethylatedAdapter）；（5）2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行片段選擇，切膠回收目的片段；（6）Bisufile 處理（C-T 轉(zhuǎn)化）和回收；（7）PCR 擴(kuò)增 WGBS 文庫。

2.4.2 WGBS文庫構(gòu)建的質(zhì)控待文庫構(gòu)建完成后，先使用 Qubit 2.0 熒光定量儀進(jìn)行初步定量，隨后使用 Aglient 2100 Bioanalyzer 對(duì)文庫的插入片段大�。╥nsert size）進(jìn)行檢測(cè)，insersize 符合預(yù)期后，使用 StepOnePlusTMReal-Time PCR system 進(jìn)行 Q-PCR 檢測(cè)，對(duì)文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫濃度＞10nM 視為有效），以保證文庫質(zhì)量。2.5 高通量測(cè)序及質(zhì)量控制經(jīng)檢測(cè)合格后，進(jìn)行高通量測(cè)序。2.5.1高通量測(cè)序的情況采用Illumina公司的Illumina Hiseq Xten測(cè)序儀，測(cè)序策略為PE150（pair-end 150bp），即兩端各測(cè)150bp的序列，平均測(cè)序深度在30X以上，然后與參考基因組進(jìn)行配對(duì)，得到的唯一與參考基因組匹配的胞嘧啶甲基化信息用于后續(xù)甲基化信息分析。

化為Clean Reads，用于后續(xù)信息分析，如下：（1） 剔除接頭被污染的Reads（雙端測(cè)序中，如果有一端超過5bp的序列到接頭污染，則同時(shí)剔除兩端Reads）；（2） 剔除質(zhì)量較低的Read（s如果質(zhì)量值Q低于19的堿基數(shù)目占總堿基數(shù)的比例超過15％，則視為質(zhì)量低；雙端測(cè)序中，若有一端Reads的質(zhì)量較低同時(shí)剔除兩端Reads）；（3） 剔除含N（N表示任何一個(gè)堿基，由于測(cè)序質(zhì)量太差，故軟件無法別是哪個(gè)堿基）比例超過10%的Reads（雙端測(cè)序中，如果有一端Reads的比超過5%，則同時(shí)剔除兩端Reads）第二部分 腎組織全基因組 DNA 甲基化圖譜的構(gòu)建

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本文編號(hào)：2820124