研究背景膀胱癌(bladder cancer, BC)為泌尿系常見的惡性腫瘤之一,年新增病例38.63萬,死亡病例15.02萬,發(fā)病率在全球范圍內排名惡性腫瘤第九位,致死率列全球男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤第二位。發(fā)達國家中膀胱癌發(fā)病率排名男性惡性腫瘤第四位,于發(fā)展中國家排第七位。盡管75%的病例屬于五年生存率較高的非肌層浸潤膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer, NMIBC),另外25%的肌層浸潤膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer, MIBC)在首次積極治療后卻容易發(fā)生轉移。因此,探尋基于分子網絡的新型治療模式、早期診斷及預后標志物成為近年來的研究熱點。microRNAs (miRNAs)系一類平均長度22個核苷酸、內源性、非編碼、小RNA分子,通過與其靶mRNA分子3'非編碼區(qū)(3'untranslated regions,3'-UTR)特異的堿基部分完全或不完全配對結合從而導致其發(fā)生降解或翻譯抑制,于轉錄后水平調控基因表達。研究證實,miRNAs可調控60%的人類蛋白編碼基因,并在多種病理生理進程中發(fā)揮關鍵作用。miRNAs既可作為抑癌基因又可作為原癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。鑒于其疾�。M織特異性表達圖譜及驚人的調控潛能,miRNAs已經成為腫瘤診斷及預后標志物。研究發(fā)現(xiàn),microRNA-214 (miR-214)在惡性黑色素瘤中表達上調并參與疾病進展與腫瘤遠處轉移；而在宮頸癌、乳腺癌及肝細胞癌中則表達下調并發(fā)揮抑癌基因作用。以上證據(jù)表明miR-214在不同類型腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要、多樣化作用,而其潛在機制有待進一步闡明。已有miRNA圖譜研究證明膀胱癌中miR-214異常表達,然而目前國內外關于miR-214在膀胱癌中的功能分析及分子調控網絡的報道很少。膀胱鏡與尿脫落細胞學是當前膀胱癌診斷與預后監(jiān)測的主要手段。然而前者具有侵入性、價格昂貴、很難發(fā)現(xiàn)扁平型腫瘤及原位癌；后者特異性高但對低分級的膀胱癌不敏感。因此,探尋新型、非侵入性、高敏感性、高特異性的循環(huán)標志物對于膀胱癌的早期診斷與預后判斷尤為重要。研究表明,腫瘤特異性循環(huán)miRNAs可能成為非侵入性腫瘤標志物,因其由胞外管狀結構(外來體)保護而免于被降解,故能穩(wěn)定存在于多種體液中(包括血清、血漿、尿液、淚水、支氣管灌洗液、初乳、母乳、腦脊液、胸水、腹水、精液、羊水)。本研究中,我們假定尿循環(huán)miR-214水平可以反映膀胱癌腫瘤組織中miR-214表達狀態(tài),探究其能否被檢測、是否可成為非侵入性腫瘤標志物。明確循環(huán)miRNAs表達譜是否反映腫瘤組織miRNAs表達譜對于提高循環(huán)腫瘤標志物的總體診斷特異性至關重要。鑒于此,本課題旨在通過檢測膀胱癌患者組織和尿液中miR-214的表達情況,并通過體外調控膀胱癌細胞系中miR-214基因表達水平、尋找并確定其下游靶基因、進行相關細胞功能實驗,探究miR-214在膀胱癌早期診斷和預后判斷中的價值及其在膀胱癌增殖、凋亡、遷移、侵襲等過程中的功能意義和分子調控機制,為尋找膀胱癌診斷、預后及治療新靶點提供依據(jù)。第一部分膀胱癌組織中miR-214分子表達及其與臨床病理參數(shù)和預后間的關系目的：檢測膀胱癌組織中miR-214分子表達情況,并探討miR-214與膀胱癌臨床病理參數(shù)和預后間的關系。方法：1.采用實時定量PCR技術(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測106對膀胱癌新鮮冰凍組織(包括31例NMIBC和75例MIBC)及癌旁正常組織中miR-214分子含量。2.用Mann-Whitney U或Kruskal-Wallis檢驗分析miR-214表達情況與膀胱癌病人臨床病理參數(shù)之間的關系。3.以單變量Kaplan-Meier生存分析描繪miR-214和其它變量的生存曲線,通過log-rank檢驗比較各生存曲線之間的差異。4.用多變量Cox比例風險回歸模型評估m(xù)iR-214及其它參數(shù)在膀胱癌中的預后價值。結果：1.與配對癌旁正常組織(中位相對表達量為0.864)相比,74%的膀胱癌組織中miR-214的表達水平(中位相對表達量為0.084)顯著下調(P0.001)。2.膀胱癌組織中miR-214表達下調與患者的NMIBC病史(P=0.033)、腫瘤多發(fā)性(P=0.003)、較高的腫瘤臨床分級(P0.001)、較高的腫瘤臨床分期(P0.001)及較高的局部淋巴結轉移狀態(tài)(P0.001)呈顯著相關性。3.隨訪期間,54.7%(58/106)的患者膀胱癌復發(fā),五年總體生存率為61.3%(65/106)。Kaplan-Meier生存曲線分析表明,miR-214低表達組患者的無復發(fā)生存期(Reccurrence-free survival, RFS)(log-rank test=26.207; P0.001)和總體生存期(Overall survival, OS)(log-rank test=45.174; P0.001)均明顯低于miR-214高表達組。多參數(shù)Cox比例風險回歸模型分析顯示miR-214表達水平并不是RFS(P=0.269)與OS(P=0.397)的獨立預后因子。4.對NMIBC組與MIBC組分別進行分析,結果顯示：NMIBC組中,54.8%(17/31)的患者出現(xiàn)復發(fā),但Kaplan-Meier生存曲線分析顯示miR-214下調無法預測RFS與OS；MIBC組中,54.7%(41/75)的患者出現(xiàn)局部或轉移性復發(fā),五年總體生存率為45.3%(34/75)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示miR-214下調與膀胱癌預后不良密切相關(RFS:log-rank test=14.214, P0.001;OS:log-rank test=13.797, ?0.001)。Cox回歸分析表明miR-214表達水平是RFS (RR=0.178;95%CI, 0.072-0.443;P0.001)與OS (RR=0.230;95%CI,0.097-0.547;P0.001)的獨立預后因子。結論：miR-214分子于膀胱癌組織中表達下調,且與膀胱癌負面性臨床病理特征顯著相關,提示其可能在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用；miR-214表達水平是MIBC患者RFS與OS獨立的預后因子。4.用多變量Cox比例風險回歸模型評估m(xù)iR-214及其它參數(shù)在膀胱癌中的預后價值。結果：1.與配對癌旁正常組織(中位相對表達量為0.864)相比,74%的膀胱癌組織中miR-214的表達水平(中位相對表達量為0.084)顯著下調(P0.001)。2.膀胱癌組織中miR-214表達下調與患者的NMIBC病史(P=0.033)、腫瘤多發(fā)性(P=0.003)、較高的腫瘤臨床分級(P0.001)、較高的腫瘤臨床分期(P0.001)及較高的局部淋巴結轉移狀態(tài)(P0.001)呈顯著相關性。3.隨訪期間,54.7%(58/106)的患者膀胱癌復發(fā),五年總體生存率為61.3%(65/106)。Kaplan-Meier生存曲線分析表明,miR-214低表達組患者的無復發(fā)生存期(Reccurrence-free survival, RFS)(log-rank test=26.207; P0.001)和總體生存期(Overall survival, OS)(log-rank test=45.174; P0.001)均明顯低于miR-214高表達組。多參數(shù)Cox比例風險回歸模型分析顯示miR-214表達水平并不是RFS(P=0.269)與OS(P=0.397)的獨立預后因子。4.對NMIBC組與MIBC組分別進行分析,結果顯示：NMIBC組中,54.8%(17/31)的患者出現(xiàn)復發(fā),但Kaplan-Meier生存曲線分析顯示miR-214下調無法預測RFS與OS；MIBC組中,54.7%(41/75)的患者出現(xiàn)局部或轉移性復發(fā),五年總體生存率為45.3%(34/75)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示miR-214下調與膀胱癌預后不良密切相關(RFS:log-rank test=14.214, P0.001;OS:log-rank test=13.797, ?0.001)。Cox回歸分析表明miR-214表達水平是RFS (RR=0.178;95%CI, 0.072-0.443;P0.001)與OS (RR=0.230;95%CI,0.097-0.547;P0.001)的獨立預后因子。結論：miR-214分子于膀胱癌組織中表達下調,且與膀胱癌負面性臨床病理特征顯著相關,提示其可能在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用；miR-214表達水平是MIBC患者RFS與OS獨立的預后因子。第二部分miR-214在膀胱癌致病中的生物學功能及調控機制研究目的：通過體外調控膀胱癌細胞系中miR-214基因表達水平、尋找并確定其下游靶基因、進行相關細胞功能實驗,探究miR-214在膀胱癌致病中的生物學功能意義和分子調控機制。方法：1.采用qRT-PCR方法檢測miR-214在正常人膀胱永生化上皮細胞(SV-HUC-1)和兩種膀胱癌細胞系(T24、5637)中的表達情況。2.體外用脂質體2000將miR-214模擬物(miR-214 mimic)瞬時轉染至膀胱癌細胞(T24、5637),同時設立陰性對照組(轉染miR-214陰性對照,miR-NC組)和空白對照組(只轉染脂質體,mock組);qRT-PCR方法評估各組轉染效率；采用CCK8實驗、劃痕實驗、Transwell實驗及Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術檢測轉染后細胞的增殖、遷移、侵襲能力及凋亡的變化；Western blot分析轉染后caspase-3與caspase-3裂解片段的含量變化。3.利用綜合生物學信息分析平臺starBase v 2.0,聯(lián)合應用5種算法(targetScan、 picTar、PITA、RNA22和miRanda)尋找并確定miR-214的靶基因；構建靶基因野生型及突變型雙熒光素酶報告載體(pmiR-ReportrTM vectors),與miR-214mimic或miR-NC共轉染膀胱癌細胞(T24、5637),并用雙熒光素酶報告系統(tǒng)進行驗證；用qRT-PC及Western blot分別檢測轉染miR-214 mimic后膀胱癌細胞中靶基因mRNA及蛋白含量。4.應用qRT-PCR檢測膀胱癌及癌旁正常組織中靶基因含量;采用Mann-WhitneyU檢驗或Kruskal-Wallis檢驗分析靶基因表達情況和膀胱癌患者臨床病理參數(shù)之間的關系；以Kaplan-Meier法描繪靶基因的生存曲線,并用log-rank檢驗比較各生存曲線之間的差異；用Cox比例風險回歸模型評估靶基因在膀胱癌預后判斷中的價值。5.通過siRNA干擾膀胱癌細胞系(T24、5637)中靶基因的表達水平,用qRT-PCR及Western blot評估各組轉染效率；采用CCK8實驗、劃痕實驗、Transwell實驗與Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術分析干擾后細胞的增殖、遷移、侵襲能力及凋亡的變化；Western blot檢測干擾后caspase-3及caspase-3裂解片段的含量變化。結果：1.miR-214在兩種膀胱癌細胞中的表達與永生化上皮細胞相比顯著下調(P0.001)。2.轉染]miR-214 mimic 24h后,T24和5637細胞中miR-214含量分別是mock, miR-NC組的22319±2284倍(T24,P0.001)與10276±1836倍(5637,P0.001);與mock組、NC組比較,miR-214 mimic轉染組細胞在轉染后48h、72h、96h三個時間段里生長速度明顯減緩,差異存在統(tǒng)計學意義(P0.001)；劃痕實驗中,轉染24h后miR-214 mimic組傷口愈合率(T24,15.17%±2.86%；5637,43.33%±3.33%)明顯低于mock組(T24,82.00%±1.41%;5637,75.67%±3.08%)和NC組(T24,80.83%±3.60%；5637,75.00%±3.52%),均有顯著性差異(P0.001)；Transwell遷移實驗中,T24細胞miR-214 mimic組穿膜細胞數(shù)為mock組的(49.46±4.36)%,5637細胞miR-214 mimic組穿膜細胞數(shù)為mock組的(25.42±2.36)%,存在統(tǒng)計學差異(P0.001)；Transwell侵襲實驗中,miR-214mimic組細胞的穿膜率(T24,11.67%±3.72%；5637,3.40%±0.32%)明顯低于mock組(T24,41.17%±6.21%；5637,26.17%±3.19%)和NC組(T24,40.50%±5.79%;5637,25.17%±4.07%),均存在顯著性差異(P0.001)；轉染膀胱癌細胞24h后,miR-214 mimic組的凋亡率(T24,57.10%±2.85%；5637,41.94%±2.84%),明顯高于mock組(T24,18.61%±1.56%；5637,12.72%±3.26%)和NC組(T24,18.81%±1.57%；5637,13.05%±3.17%),差異皆具統(tǒng)計學意義(P0.001)；轉染48h后,miR-214 mimic 組 caspase-3與caspase-3裂解片段蛋白含量均明顯高于NC組。3.四種算法(targetScan、picTar、PITA與miRanda)一致預測PDRG1的3'-UTR存在miR-214的互補結合位點；雙熒光素酶報告系統(tǒng)結果證實PDRG1為miR-214的下游靶基因(P0.001)；與]mock組、NC組比較,miR-214 mimic組PDRG1 mRNA(P0.001)及蛋白含量均明顯降低。4.與配對癌旁正常組織(中位相對表達量為0.00024)相比,81%的膀胱癌組織中PDRG1的表達水平(中位相對表達量為0.00632)顯著上調(P0.001)。PDRG1與miR-214在膀胱癌組織中表達呈負相關(r=-0.367,P0.001)。膀胱癌組織中PDRG1表達上調與患者的性別(P=0.012)、較高的腫瘤臨床分級(P=0.001)、較高的腫瘤臨床分期(P0.001)及較高的局部淋巴結轉移狀態(tài)(P0.001)顯著相關。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,PDRG1高表達組患者的RFS(log-rank test=6.578;P=0.010)和OS (log-rank test=8.990; P=0.003)均明顯低于PDRG1低表達組。Cox回歸模型分析顯示PDRG1表達水平并不是RFS (P=0.457)與OS(P=0.145)的獨立預后因子。對NMIBC組與MIBC組分別進行分析顯示,PDRG1表達量均無法預測各組的RFS與OS。5.轉染si-PDRG1 24h后,T24和5637細胞中PDRG1mRNA含量分別是mock組的0.33±0.09倍(T24,P0.001)與0.57±0.05(5637,P0.001)倍；與mock組、NC組相比,si-PDRG1轉染組細胞在轉染后48h、72h、96h三個時段里生長速度明顯變緩,存在顯著性差異(P0.001)；劃痕實驗中,si-PDRG1組傷口愈合率(T24,20.67%±2.42%；5637,52.00%±5.97%)明顯低于mock組(T24,81.00%±1.55%；5637,73.83%±2.93%)和NC組(T24,79.00%±3.52%；5637,71.83%±1.94%),差異皆具統(tǒng)計學意義(P0.001)；Transwell遷移實驗中,T24細胞si-PDRG1組穿膜細胞數(shù)為mock組的(55.78±11.23)%,5637細胞si-PDRG1組穿膜細胞數(shù)為mock組的(35.59±2.28)%,皆具顯著性差異(P0.001)；Transwell侵襲實驗中,si-PDRG1組細胞的穿膜率(T24,14.33%±2.94%；5637,7.00%±2.61%)明顯低于mock組(T24,44.50%±2.35%；5637,31.00%±2.61%)和NC組(T24,43.83%±2.99%；5637,29.67%±4.89%),差異存在統(tǒng)計學意義(P0.001)；轉染24h后,si-PDRG1組的凋亡率(T24,52.83%±4.23%;5637,34.75%±3.39%)明顯高于mock組(T24,16.89%±1.69%;5637,11.16%±2.51%)和NC組(T24,17.07%±1.82%；5637,11.41%±2.50%),均有顯著性差異(P0.001)；轉染48h后,si-PDRG1組,PDRG1蛋白含量明顯低于NC組,而caspase-3與caspase-3裂解片段蛋白含量明顯高于NC組。結論：本研究首次證實miR-214在膀胱癌中發(fā)揮抑癌基因作用,其通過直接下調癌基因PDRG1,從而抑制膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲,促進凋亡；同時本研究也為膀胱癌靶向基因治療提供實驗依據(jù)。OS(P=0.145)的獨立預后因子。對NMIBC組與MIBC組分別進行分析顯示,PDRG1表達量均無法預測各組的RFS與OS。5.轉染si-PDRG1 24h后,T24和5637細胞中PDRG1mRNA含量分別是mock組的0.33±0.09倍(T24,P0.001)與0.57±0.05(5637,P0.001)倍；與mock組、NC組相比,si-PDRG1轉染組細胞在轉染后48h、72h、96h三個時段里生長速度明顯變緩,存在顯著性差異(P0.001)；劃痕實驗中,si-PDRG1組傷口愈合率(T24,20.67%±2.42%；5637,52.00%±5.97%)明顯低于mock組(T24,81.00%±1.55%；5637,73.83%±2.93%)和NC組(T24,79.00%±3.52%；5637,71.83%±1.94%),差異皆具統(tǒng)計學意義(P0.001)；Transwell遷移實驗中,T24細胞si-PDRG1組穿膜細胞數(shù)為mock組的(55.78±11.23)%,5637細胞si-PDRG1組穿膜細胞數(shù)為mock組的(35.59±2.28)%,皆具顯著性差異(P0.001)；Transwell侵襲實驗中,si-PDRG1組細胞的穿膜率(T24,14.33%±2.94%；5637,7.00%±2.61%)明顯低于mock組(T24,44.50%±2.35%；5637,31.00%±2.61%)和NC組(T24,43.83%±2.99%；5637,29.67%±4.89%),差異存在統(tǒng)計學意義(P0.001)；轉染24h后,si-PDRG1組的凋亡率(T24,52.83%±4.23%;5637,34.75%±3.39%)明顯高于mock組(T24,16.89%±1.69%;5637,11.16%±2.51%)和NC組(T24,17.07%±1.82%；5637,11.41%±2.50%),均有顯著性差異(P0.001)；轉染48h后,si-PDRG1組,PDRG1蛋白含量明顯低于NC組,而caspase-3與caspase-3裂解片段蛋白含量明顯高于NC組。結論：本研究首次證實miR-214在膀胱癌中發(fā)揮抑癌基因作用,其通過直接下調癌基因PDRG1,從而抑制膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲,促進凋亡；同時本研究也為膀胱癌靶向基因治療提供實驗依據(jù)。第三部分尿液游離miR-214的檢測及其對膀胱癌診斷和預后價值的評估目的：評估尿游離miR-214對膀胱癌潛在的診斷和預后價值。方法：1.篩查階段通過qRT-PCR法檢測兩種膀胱癌細胞(T24、5637)培養(yǎng)液上清以評估m(xù)iR-214的分泌性,并檢測20例膀胱癌患者與20例健康對照者尿游離miR-214表達。2.確證階段采用qRT-PCR法測定272例膀胱癌術前尿、80例配對術后尿、169例健康對照者尿液中游離miR-214水平及79例配對膀胱癌組織中miR-214水平。3.用Mann-Whitney U或Kruskal-Wallis檢驗分析尿游離miR-214表達情況和膀胱癌病人臨床病理參數(shù)之間的關系。4.通過受試者工作曲線(receiver operating characteristic, ROC)評估尿游離miR-214對膀胱癌的診斷效能。5.以單變量Kaplan-Meier法描繪尿游離miR-214的生存曲線,并用log-rank test比較各生存曲線之間的差異。6.用多變量Cox比例風險回歸模型評估尿游離miR-214對膀胱癌的預后價值。結果：1.膀胱癌細胞分泌miR-214分子至培養(yǎng)液中,且篩查階段膀胱癌患者尿游離miR-214水平明顯低于健康對照者(P0.001)。2.確證階段膀胱癌患者術前尿游離miR-214水平與健康對照者相比明顯降低(P0.001),且術后顯著性升高(P0.001)。膀胱癌患者術前尿游離miR-214與配對腫瘤組織中miR-214表達水平顯著正相關(r=0.6539,95% CI=0.5010-0.7673,P0.001)。3.膀胱癌患者尿游離miR-214表達下調與患者的年齡(P=0.028)、NMIBC病史(P=0.044)、較高的腫瘤臨床分級(P0.001)、較高的腫瘤臨床分期(P0.001)、較高的局部淋巴結轉移狀態(tài)(P0.001)之間相關性明顯。4.尿游離miR-214診斷膀胱癌的ROC曲線下面積(area under the curve, AUC)為0.838(95% CI=0.796-0.875),最佳臨界值為0.1551,診斷敏感性為90.53%,特異性為65.62%,陽性預測值為69.90%,陰性預測值為88.70%。5.隨訪過程中,58.9%(113/192)的膀胱癌患者出現(xiàn)腫瘤復發(fā),五年總體生存率為57.3%(110/192)。Kaplan-Meier生存曲線分析表明,尿游離miR-214低表達組患者的RFS (log-rank test=29.734;P0.001)和OS (log-rank test=61.711; P0.001)均明顯低于miR-214高表達組。多參數(shù)Cox比例風險回歸模型分析顯示尿游離miR-214表達水平并不是RFS(P=0.277)與OS(P=0.667)的獨立預后因子。6.對NMIBC組與MIBC組分別進行分析,結果顯示：NMIBC組中,49.2%(31/63)的患者出現(xiàn)復發(fā),但Kaplan-Meier生存曲線分析表明尿游離miR-214下調無法預測RFS與OS；MIBC組中,63.6%(82/129)的患者出現(xiàn)局部或轉移性復發(fā),五年總體生存率為36.4%(47/129)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示尿游離miR-214下調與膀胱癌預后不良密切相關(RFS:log-rank test=37.381,P0.001; OS:log-rank test=37.376, P0.001). Cox回歸分析表明尿游離miR-214表達水平是RFS(RR=0.264; 95%CI,0.149-0.468;P0.001)與OS(RR=0.282;95%CI,0.160-0.495;P0.001)的獨立預后因子。結論：尿游離miR-214可作為膀胱癌腫瘤分層、早期診斷及預后判斷的有前景的無創(chuàng)性標志物。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R737.14

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 ;Cancer Incidence and Mortality in China,2007[J];Chinese Journal of Cancer Research;2012年01期

本文編號：2820109