第一部分特發(fā)性無精子癥患者皮膚成纖維細胞分離與培養(yǎng)目的建立一種標準化的且可重復操作的人皮膚成纖維細胞分離培養(yǎng)方法,并從形態(tài)學,免疫組織化學及細胞增殖能力等方面對培養(yǎng)的真皮成纖維細胞進行鑒定。方法1.特發(fā)性無精子癥患者的皮膚標本取自顯微取精手術切口,正常對照的皮膚標本來自行包皮環(huán)切手術的生育力正常男性。相關手術操作由專業(yè)泌尿外科醫(yī)生在無菌條件下進行。所有臨床標本收集均告知患者用于科學研究并簽署知情同意書。2.組織塊貼壁法分離皮膚成纖維細胞及原代培養(yǎng)。3.成纖維細胞形態(tài)學分析,免疫熒光染色檢測標記物VIMENTIN的表達。4.流式細胞分析檢測免疫表型。5.細胞生長曲線繪制。6.MTT檢測細胞增殖能力。結果1.在原代細胞培養(yǎng)過程中,成纖維細胞具有典型的形態(tài)特征,表達III型中間絲蛋白家族成員VIMENTIN。2.生長動力學分析表明成纖維細胞增殖能力強,活性較好,凍存過程對其形態(tài)和生長特征無明顯影響。3.流式分析結果表明第3代成纖維細胞普遍表達表面分子CD73,CD90,CD44,CD105(陽性比例分別為98.5%,100%,99.8%及98.1%),幾乎不表達CD45與CD34(陽性比例均為0.4%),提示細胞純度高。結論采用皮膚組織塊貼壁法可成功分離得到高純度的真皮成纖維細胞。在原代細胞培養(yǎng)過程中,成纖維細胞具有典型的形態(tài)特征,增殖能力強,免疫組織學分析提示細胞純度高,凍存過程亦對其生長特征無明顯影響,能夠滿足后續(xù)實驗所需。第二部分特發(fā)性無精子癥患者誘導多能干細胞構建及鑒定目的利用重編程技術構建特發(fā)性無精子癥患者的誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs),并對其多能性進行鑒定,使之更有效地應用于后續(xù)的分化研究。方法1.分離培養(yǎng)特發(fā)性無精子癥患者的真皮成纖維細胞,然后用攜帶OCT4,SOX2,KLF4,C-MYC四個重編程轉錄因子的逆轉錄病毒感染皮膚成纖維細胞,促使其重編程為iPSCs。2.免疫組織化學檢測iPSCs多能性標記物NANOG,SOX2,OCT4,TRA-1-60及SSEA-4的表達。3.免疫組織化學檢測iPSCs堿性磷酸酶(AP)的表達。4.RT-PCR檢測iPSCs多能基因OCT4,SOX2,KLF4,C-MYC,NANOG及LIN28的相對表達水平。5.流式細胞分析檢測iPSCs多能基因OCT4,SOX2及NANOG蛋白水平表達。6.核型分析。結果1.我們共構建兩例特發(fā)性非梗阻性無精子患者的iPSCs,分別命名為iPSC1106和iPSC1122,同時我們也構建了一例正常男性的iPSCs。2.所有獲得的iPS細胞系均陽性表達多能性表面抗原SSEA-4,TRA-1-60及核轉錄因子OCT4,NANOG,SOX2。3.特發(fā)性男性不育患者及正常男性iPSCs均表達多能性相關基因OCT4,SOX2,KLF4,C-MYC,LIN28,NANOG,REX,TDGF及HTERT,且AP陽性。4.我們通過畸胎瘤及擬胚體形成實驗分別證實了所得iPSCs具有體內及體外向三胚層分化的能力。5.所得iPSCs均具有正常核型,重編程過程并未影響染色體穩(wěn)定性。結論特發(fā)性無精子癥患者iPSCs在形態(tài)學,多能基因表達水平及三胚層分化能力上與正常男性來源的iPSCs及人胚胎干細胞(embryonic stem cells,h ESCs)無明顯區(qū)別。核型分析結果提示,重編程過程并未引起核型異常,為后續(xù)的分化研究奠定了基礎。第三部分特發(fā)性無精子癥患者誘導多能干細胞向原始生殖細胞誘導分化目的探索特發(fā)性無精子癥患者的iPSCs體外向原始生殖細胞(primordial germ cells,PGCs)分化的能力,并將其異種移植入小鼠的生精小管,觀察其體內的分化能力。方法1.特發(fā)性無精子癥患者及正常男性iPSCs,h ESCs體外向PGCs誘導分化,主要通過兩步誘導法,包括類中胚層階段誘導及PGC階段誘導。2.RT-PCR及免疫熒光染色檢測特發(fā)性無精子癥患者iPSCs體外分化過程中PGC特異性基因表達變化。3.RT-PCR及免疫熒光染色檢測特發(fā)性無精子癥患者iPSCs體外分化過程中多能性相關基因的表達變化。4.RT-PCR檢測特發(fā)性無精子癥患者iPSCs體外分化過程中三胚層基因的表達變化。5.流式細胞分析檢測特發(fā)性無精子癥患者iPSCs體外分化效率,主要采用Ep CAM/INTEGRINα6以及c-KIT/INTEGRINα6雙陽性細胞的比例做為評價指標。6.特發(fā)性無精子癥患者iPSCs異種移植至無精子癥模型小鼠生精小管并觀察其分化情況。結果1.經過兩天的預誘導過程,貼壁培養(yǎng)的iPSCs呈現扁平上皮細胞形態(tài),且細胞邊界清晰。進入懸浮誘導培養(yǎng)階段,細胞形成擬胚體球。2.PGC誘導第4天,四個細胞系形成的擬胚體均表達PGC早期特化相關的基因TFAP2C,BLIMP1,PRDM14,OCT4和NANOS3,仍低表達甚至不表達DPPA3及晚期PGC相關基因DDX4及DAZL。3.除iPSC1122外,其他三個細胞系在預誘導后均明顯下調了PRDM14基因的表達。PGC誘導第4天,四個細胞系形成的擬胚體均表達相似水平的多能性相關基因OCT4和NANOG,但是SOX2基因表達明顯抑制。與未分化的多能細胞相比,PGC誘導后的擬胚體表達較高水平的內細胞團相關基因ZFP42,KLF4及TFCP2L1。4.PGC誘導第4天,四個細胞系形成的擬胚體明顯下調內胚層基因GATA6,中胚層基因RUNX2和EOMES,及外胚層基因PAX6的表達,上調內胚層基因SOX17的表達,且SOX17陽性的細胞均不表達多能性基因SOX2。特發(fā)性無精子癥患者iPSCs(1106和1122)經過預誘導后所得的類中胚層樣細胞(incipient mesoderm-like cells,i Me LCs)相比于正常iPSCs及ESCs來源的i Me LCs,中胚層基因EOMES的表達相對較低,而且iPSC1106經PGC誘導分化后所得的擬胚體SOX17基因的表達也明顯較低。5.不同來源的iPSCs分化所得的擬胚體中Ep CAM/INTEGRINα6雙陽性細胞比例相似,然而,病人來源的iPSCs分化所得的c-KIT/INTEGRINα6雙陽性細胞比例相對較低。6.異種移植體內實驗表明,不同來源的iPSCs均具有定植于小鼠生精小管基底膜的趨勢,且明顯表達生殖細胞特異基因DDX4,但是無精子癥患者iPSCs增殖能力相對有限,且DDX4陽性細胞比例相對較低。結論通過體外模擬人類生殖細胞早期發(fā)育的信號調控及分子環(huán)境(ACTA,CHIR,BMP4,LIF,SCF,EGF等因子的一系列作用),特發(fā)性無精子癥患者iPSCs具有體外向原始生殖細胞樣細胞(PGC-like cells,PGCLCs)分化的能力,但是與正常iPSCs及ESCs相比,特發(fā)性無精子癥患者iPSCs在體外向PGCLCs誘導分化過程中三胚層基因的表達情況,誘導效率及體內分化潛力存在一定的差異,這些差異可能與無精子癥發(fā)生的遺傳或表觀遺傳背景相關。第四部分原始生殖細胞樣細胞全轉錄組測序分析及比對目的對特發(fā)性無精子癥患者iPSCs及其體外分化所得i Me LCs和PGCLCs進行高通量全轉錄組測序分析,并與正常iPSCs及ESCs來源的PGCLCs和已發(fā)表的人性腺PGCs轉錄組數據進行比對分析,為進一步的研究及臨床應用奠定基礎。方法1.流式分選PGC誘導第4天擬胚體中Ep CAM/INTEGRINα6雙陽性的PGCLCs。2.對各細胞樣本進行RNA-seq分析(iPSCs/ESCs,i Me LCs及PGCLCs)。3.測序數據生物信息學分析。4.PGC體外誘導過程中全轉錄組與人類性腺PGC全轉錄組比對分析。5.免疫熒光染色檢測PGC誘導第4天擬胚體中表觀遺傳相關分子的表達。結果1.我們一共完成24個樣品的轉錄組測序分析,共獲得127.11Gb Clean Data,各樣品Clean Data均達到4.54Gb,Q30堿基百分比在74.59%及以上。分別將各樣品的Clean Reads與指定的參考基因組進行序列比對,比對效率從62.28%到94.72%不等。2.不同細胞系在PGC誘導的不同階段均有明顯的基因表達譜變化,我們將差異表達基因進行層次聚類分析,病人特異性iPSCs的聚類模式與正常iPSCs明顯不同。3.對四個細胞系共同上調和下調的基因進行GO富集分析發(fā)現,由iPSCs或ESCs向i Me LCs預誘導過程中,上調基因富集于BMP信號通路,WNT信號通路,細胞遷移調控及男性性腺發(fā)育調控等GO分類,而下調基因富集于細胞黏附,神經系統(tǒng)分化,細胞分化及胚胎發(fā)育調控等GO分類。由i Me LCs向PGCLCs誘導分化過程中,上調基因富集于細胞遷移調控,細胞增殖調控,男性性腺發(fā)育及細胞外基質合成等GO分類,而下調基因富集于神經發(fā)育等GO分類。4.特發(fā)性無精子癥患者iPSCs體外分化過程中的基因表達與小鼠PGC的特化既存在相似之處,也存在明顯差異。5.特發(fā)性無精子癥患者iPSCs與正常iPSCs及ESCs呈現一致的染色結果,在誘導第4天,大部分TFAP2C陽性的細胞不表達5m C,而表達5hm C,提示去甲基化趨勢,且TFAP2C陽性的細胞均表達TET1。特發(fā)性無精子癥病人iPSCs分化第4天,OCT4陽性的細胞仍持續(xù)表達DNMT3A,而對于正常iPSCs和ESCs,在PGC特化的第4天,OCT4陽性的PGCLCs大部分不表達DNMT3A。6.通過與人性腺PGC轉錄組進行比對,體外誘導PGC特化與體內PGC特化過程中部分基因的表達動態(tài)相似,但是仍有大量的基因表達譜差異明顯。結論從基因表達譜分析,特發(fā)性無精子癥患者iPSCs經過i Me LCs階段誘導可以體外分化為處于早期階段的PGCLCs,但特發(fā)性無精子癥患者iPSCs在體外PGC誘導過程中某些關鍵基因的表達水平相對較低,而且體外PGC特化仍不能完全模擬體內PGC的發(fā)育過程,這些都可能與早期生殖細胞發(fā)育的遺傳缺陷相關,仍需進行深入研究。同時,特發(fā)性無精子癥患者iPSCs與對照iPSCs和ESCs相似,均在體外PGC誘導的過程中一定程度起始了DNA去甲基化等全基因組表觀遺傳變化。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R698.2
【部分圖文】：

梭形的成纖維細胞開始從組織塊邊緣游離出來（圖1-1-B）；第 18-20 天，成纖維細胞生長迅速，細胞密度增加（圖 1-1-C）；在致密的細胞簇中，細長梭形的成纖維細胞邊界清晰，相鄰細胞平行生長，多層重疊，呈典型的漩渦狀（圖 1-1-D）；在連續(xù)傳代或凍存復蘇后，成纖維細胞仍保持典型的形態(tài)（圖 1-1-E，F）。2. 成纖維細胞增殖潛能如圖 1-2-A 生長曲線所示，組織塊貼壁法獲得的第 3 代成纖維細胞的數量倍增階段相對較短，前 6 天，細胞數目與培養(yǎng)時間基本正相關，經過 2 天的細胞潛伏期后

皮膚組織貼壁法培養(yǎng)的成纖維細胞生長曲線及增殖特點

成纖維細胞的流式細胞免疫表型分析

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 姜輝;田楊;黃錦;趙連明;唐文豪;洪鍇;毛加明;;重視染色體基因缺陷對男性生育的影響[J];北京大學學報(醫(yī)學版);2012年04期

2 吳f替

本文編號：2819985