目的:糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病(diatetes mellitus,DM)最常見的微血管并發(fā)癥之一,已經(jīng)成為終末期腎臟疾病首要疾病基礎(chǔ)。微量白蛋白尿(microalbuminuria,MAU)被認(rèn)為是DKD診斷的主要依據(jù)。但長期研究表明,MAU作為早期DKD的診斷指標(biāo),靈敏度差,特異性不高。研究發(fā)現(xiàn),在DM前期的患者中,約13.1%的患者已出現(xiàn)MAU,即一部分DKD患者的腎損害可能在糖耐量異常(impaired glucose tolerance,IGT)期就已經(jīng)發(fā)生。我們前期動物實(shí)驗(yàn)已證實(shí),在IGT期腎臟已出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的改變,因此,相對于DKD我們將這一階段出現(xiàn)的腎損害稱為“IGT腎病”~([1])。盡管在動物實(shí)驗(yàn)中觀察到在糖尿病前期已出現(xiàn)腎臟損害,但“IGT腎病”仍需在臨床上進(jìn)一步驗(yàn)證,其診斷依據(jù)以及發(fā)病機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。研究發(fā)現(xiàn)多種早期診斷DKD的生物標(biāo)志物,如:肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(liver-fatty acid binding protein,L-FABP)、免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)、腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1,Kim-1)、β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)、胱抑素(Cysatin C,CysC)等,但這些標(biāo)志物在“IGT腎病”是否有改變,也需在臨床上進(jìn)一步驗(yàn)證。通過蛋白組學(xué)-iTRAQ技術(shù),篩選出差異候選蛋白Vasorin(VASN)。VASN是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白,在腎臟中表達(dá),VASN參與體內(nèi)血管修復(fù)、腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程。但VASN蛋白能否作為早期“IGT腎病”的生物標(biāo)志物以及是否參與“IGT腎病”的發(fā)病機(jī)制也有待進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究從284名體檢對象中隨機(jī)抽取89名研究對象,分為健康對照組(NC)、IGT組、“IGT腎病”組(IGT nephropathy,IGTN)、2型糖尿病組(DM)、2型糖尿病腎病組(DKD),觀察不同人群腎損傷標(biāo)志物、VASN等指標(biāo)的變化,在臨床上進(jìn)一步驗(yàn)證IGT患者是否存在腎損傷以及VASN在“IGT腎病”中的診斷價(jià)值,并初步探討VASN在“IGT腎病”發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮的作用。方法:1.收集實(shí)驗(yàn)各組人群的一般資料及標(biāo)本。檢測血糖、血脂、肝腎功、胰島素、24h尿微量白蛋白(urinarymicroalbumin,UMA)、視黃醇結(jié)合蛋白(retinol binding protein,RBP)、β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-beta-D-glucosaminidase,NAG)、免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin,TF)、L-FABP、Kim-1、CysC和VASN。檢驗(yàn)VASN在“IGT腎病”中的變化及診斷價(jià)值。2.取課題組前期實(shí)驗(yàn)高脂飼料喂養(yǎng)Zucker Diabetic Fatty(fa/fa,ZDF)大鼠至IGT、DM階段以及同齡健康Zucker Lean(fa/+,ZL)模型鼠的腎臟組織,檢測VASN在腎臟的定位表達(dá)以及VASN的表達(dá)水平。3.以人腎小管上皮細(xì)胞為研究對象,分為正常對照組、缺氧組,檢測VASN、硫氧還蛋白2(thioredoin 2,TRX2)、活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)水平以及對腎小管上皮細(xì)胞對白蛋白的重吸收的能力。4.分別用小干擾RNA(siRNA)、EX-I1533-M03質(zhì)粒降低和過表達(dá)VASN,缺氧處理后,檢測腎小管上皮細(xì)胞VASN、TRX2、ROS水平以及其重吸收功能的改變。結(jié)果:1.IGTN組腎小球?yàn)V過率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)較NC組升高(P0.05);腎臟大小:IGTN組較NC、IGT組腎長徑增加(P0.05)。2.腎損傷指標(biāo):與NC組相比,IGTN組UMA、TF、CysC、GAL、NAG、NGAL、KIM-1、L-FABP均升高(P0.05)。3.尿VASN:與NC組相比,IGTN組下降約27%(P0.05)。4.在IGTN組,尿VASN與CysC、GAL、NAG、NGAL呈負(fù)相關(guān),ROC曲線:對“IGT腎病”診斷的靈敏度為78.6%,特異度為64.7%(P0.05)。5.免疫組化觀察VASN在大鼠腎臟的表達(dá)情況:VASN主要分布于腎小管區(qū)。與正常對照組ZL大鼠相比,在ZDF大鼠IGT期、DM期VASN表達(dá)下降(P0.05)。6.在缺氧狀態(tài)下,與NC組相比,缺氧組VASN、TRX2表達(dá)水平下降,ROS生成增多近59%,白蛋白攝取下降約50%(P0.05)。siRNA VASN組TRX2表達(dá)下降,ROS生成增多,升高近1.4倍,白蛋白攝取減少約70%;VASN過表達(dá)組TRX2的表達(dá)水平隨之升高,ROS生成減少約56%,白蛋白攝取功能較缺氧組恢復(fù)近90%(P0.05)。結(jié)論:1.在臨床上進(jìn)一步驗(yàn)證了IGT期部分患者存在腎臟損傷,表現(xiàn)為不同程度的腎小管及腎小球功能的損傷,腎小管損傷可能是此階段更主要的病理生理變化。2.通過iTRAQ技術(shù)篩選出的差異蛋白VASN有望成為“IGT腎病”早期診斷新的標(biāo)志物。3.VASN主要表達(dá)在腎小管間質(zhì)區(qū),在IGT、DM期大鼠腎臟表達(dá)下降。4.缺氧條件下,腎小管上皮細(xì)胞VASN的表達(dá)受到抑制,水平降低的VASN通過下調(diào)TRX2的表達(dá),使細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加,加劇了腎小管上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷,導(dǎo)致其重吸收功能受損。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R587.2;R692.9
【部分圖文】：

圖 1.1 腎小球損傷1.2.3 腎小管損傷標(biāo)志物比較NGAL：各組較 NC 組均有升高趨勢，在組升高（P＜0.05），其余各組間相比，無統(tǒng)組較其他四組升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜（P>0.05）；RBP：與 N、IGT、DM 組相比NC、IGT、DM 升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（PIGTN 組升高（P＜0.05），DKD 組進(jìn)一步升＜0.05），較 DM 組也升高，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異DKD 組較 N、IGT 組升高（P＜0.05），其中組進(jìn)一步升高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；DM、DKD 組均升高（P＜0.05），其中 DKDCysC：IGTN 組升高最明顯，較 NC、DM 組組較 DM 組升高（P＜0.05），DKD 組較 （P>0.05）；L-FABP:在各組中逐漸升高，較

13圖 1.2 腎小管損傷指標(biāo)比較1.2.4 VASN 比較1.2.4.1 尿 VASN與 NC 組相比，IGT、IGTN、DM、DKD 組四組均呈下降趨勢，其中 IGTN組較 N 組下降（P＜0.05），DKD 組降低最明顯，較其他四組 NC、IGT、IGTN、DM 組均降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。（表 1.4，圖 1.3）表 1.4 尿 VASN 比較注：a：與 NC 組相比 P<0.05；b：與 IGT 組相比 P<0.05；c：與 IG T N 組 相比 P<0.05；d：與 DM 組相比 P<0.05NC IGT IGTN DM DKD P 值VASN(ng/ml) 16.67±2.31 12.50±1.27 12.20±1.35a13.33±1.58 8.64±3.27abcd0.001

尿VASN比較

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本文編號：2810252