發(fā)布時間：2020-09-02 09:55

　　 第一部分FK228減輕UUO誘導的小鼠腎臟間質(zhì)纖維化【目的】探討HDAC的表達與腎臟纖維化之間的關系,以及I類HDAC抑制劑FK228在抑制腎臟纖維化進展中的作用和機制�！痉椒ā渴褂眯坌訡57BL/6小鼠建立單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型,并腹腔注射FK228進行干預。實驗分為三組:Sham組,UUO組,UUO+FK228組(0.5mg/kg/天,連續(xù)給藥7天)。在術后第7天,收集小鼠腎臟標本。對腎臟組織進行HE染色和天狼星紅染色,來評估其病理變化和纖維化程度。采用免疫組織化學染色檢測α-SMA、Collagen I和纖維粘連蛋白(fibronectin,FN)在間質(zhì)的表達情況。通過Western blot檢測小鼠腎臟中纖維化相關蛋白和乙�；M蛋白H3的表達。利用實時熒光定量PCR來檢測小鼠腎臟中纖維化相關蛋白、炎性細胞因子、HDAC1和HDAC2的m RNA水平。通過F-actin的免疫組織化學染色來檢測小鼠腎臟中成纖維細胞的活化情況�！窘Y(jié)果】腎臟組織HE染色和天狼星紅染色結(jié)果顯示,與Sham組相比,UUO組的小鼠腎臟發(fā)生明顯的間質(zhì)纖維化,腎小管顯著擴張,出現(xiàn)蛋白管型,間質(zhì)中有大量的膠原纖維沉積。腎臟中α-SMA,Collagen I,FN和F-actin的表達水平均出現(xiàn)了升高,同時HDAC1和HDAC2的m RNA水平也都顯著升高。與UUO組相比,腎臟組織HE染色和天狼星紅染色結(jié)果顯示,給予FK228干預在很大程度上改善了小鼠腎臟損害,減輕了腎小管的擴張程度及蛋白質(zhì)管型,減少了間質(zhì)中膠原的沉積(P0.05)。同時,FK228干預抑制了腎臟中纖維化相關蛋白如α-SMA、Collagen I及FN的表達(P0.05)。免疫組化結(jié)果顯示,UUO+FK228組中F-actin的表達下調(diào),表明FK228抑制了腎臟成纖維細胞的激活。蛋白水平檢測顯示,FK228使腎臟中HDAC1和HDAC2的表達減少(P0.05),乙�；M蛋白H3的表達增加(P0.05)�！窘Y(jié)論】在UUO誘導的小鼠腎臟間質(zhì)纖維化中,HDAC1和HDAC2處于高表達狀態(tài)。全身給予FK228后,通過抑制HDAC1和HDAC2的作用,促進組蛋白H3發(fā)生乙�；�,抑制成纖維細胞的激活,進一步減少炎性因子和纖維化相關指標的表達,從而發(fā)揮改善腎臟間質(zhì)纖維化的作用。第二部分FK228抑制腎臟成纖維細胞的作用及機制研究【目的】探討I類HDAC抑制劑FK228抑制腎臟間質(zhì)成纖維細胞的作用及其機制,為FK228進一步臨床應用提供實驗依據(jù)�！痉椒ā矿w外培養(yǎng)大鼠腎臟間質(zhì)成纖維細胞系(NRK-49F),將細胞接種于96孔板中,每孔104個細胞,實驗分組為:Control組、2n M、5n M、8n M、10n M、15n M、20n M、40n M、50n M、100n M、200n M、300n M;用CCK8方法檢測不同濃度的FK228對NRK-49F細胞增殖的影響。將NRK-49F細胞接種于6孔板中,每孔4×105個細胞,實驗分組為:Control組、TGF-β1組、TGF-β1+FK228(5n M)組、TGF-β1+FK228(8n M)組、TGF-β1+FK228(10n M)組、TGF-β1+FK228(15n M)組。培養(yǎng)過夜后,將完全培養(yǎng)基更換成含0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24小時,然后用FK228預處理細胞40分鐘,再用TGF-β1刺激培養(yǎng)24小時。通過流式細胞術分析FK228對NRK-49F細胞凋亡的影響。收集各組細胞,提取總蛋白和細胞核蛋白,利用Western blot方法檢測不同濃度FK228干預對NRK-49F細胞中α-SMA、FN、Collagen I、Collagen IV、PAI1、E-cadherin、HDAC1、HDAC2、乙�；M蛋白H3、Cyclin D1、P21、P27表達水平的影響,同時檢測Smad2/3、MEK1/2、ERK1/2、P38的磷酸化水平,來評估FK228對成纖維細胞中TGF-β1/Smad信號通路ERK1/2和P38 MAPK信號通路的影響�！窘Y(jié)果】TGF-β1組細胞中α-SMA、FN、Collagen I、Collagen IV、PAI1的表達水平明顯高于Control組,而E-cadherin的表達下降。TGF-β1+FK228組細胞中α-SMA、FN、Collagen I、Collagen IV、PAI1的表達較TGF-β1組顯著降低(P0.05),隨著FK228濃度的增加,抑制作用逐漸增強。在TGF-β1組細胞中,HDAC1和HDAC2的蛋白水平明顯升高,乙�；慕M蛋白H3幾乎沒有表達。而FK228能夠濃度依賴性地抑制NRK-49F細胞中HDAC1和HDAC2的表達,同時使組蛋白H3處于高度乙�；癄顟B(tài)(P0.05)。此外,CCK8結(jié)果顯示,FK228能夠有效抑制NRK-49F細胞的增殖,并且當濃度為10n M和15n M時促進其凋亡。細胞周期蛋白的Western blot檢測顯示,FK228干預使細胞周期蛋白Cyclin D1的表達下調(diào),同時使P21和P27的表達上調(diào)。在信號通路蛋白方面,Western blot結(jié)果顯示,FK228干預大大降低了NRK-49F細胞中p-Smad2/3,p-MEK1/2,p-ERK1/2,p-P38的表達,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)�！窘Y(jié)論】FK228可抑制成纖維細胞的活化增殖,降低成纖維細胞中ECM的產(chǎn)生。機制與抑制HDAC1和HDAC2的作用,促進組蛋白H3的乙�；�,阻斷TGF-β1/Smad、ERK1/2和P38 MAPK信號通路的活化有關。第三部分FK228對腎小管上皮細胞的作用及機制研究【目的】探討I類HDAC抑制劑FK228對腎小管上皮細胞的作用及其機制�！痉椒ā矿w外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細胞系(NRK-52E),將NRK-52E細胞接種于6孔板中,每孔4×105個細胞,實驗分組為:Control組、TGF-β1組、TGF-β1+FK228(5n M)組、TGF-β1+FK228(8n M)組、TGF-β1+FK228(10n M)組、TGF-β1+FK228(15n M)組。培養(yǎng)過夜后,將完全培養(yǎng)基更換成含0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24小時,然后用FK228預處理細胞40分鐘后,再用TGF-β1刺激培養(yǎng)24小時,收集各組細胞,提取總蛋白和細胞核蛋白。通過Western blot方法檢測不同濃度FK228對NRK-52E細胞中α-SMA、FN、Collagen I、Collagen IV、PAI1、E-cadherin、HDAC1、HDAC2及乙�；M蛋白H3表達水平的影響,在信號通路方面,利用Western blot檢測Smad2/3、MEK1/2、ERK1/2、P38的磷酸化水平,來評估FK228對腎小管上皮細胞中TGF-β1/Smad信號通路、ERK1/2和P38 MAPK信號通路的影響�！窘Y(jié)果】蛋白水平檢測顯示,與Control組相比,TGF-β1增加了NRK-52E細胞中α-SMA、FN、Collagen I、Collagen IV、PAI1的表達,且HDAC1和HDAC2的表達明顯上調(diào)。FK228可濃度依賴的抑制這些蛋白的表達(P0.05),同時使組蛋白H3處于高度乙�；�(P0.05)。在信號通路蛋白方面,Western blot結(jié)果顯示,FK228大大降低了NRK-52E細胞中p-Smad2/3、p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-P38的表達水平(P0.05)�！窘Y(jié)論】FK228抑制HDAC1和HDAC2的作用,使組蛋白H3處于高度乙�；�,從而抑制了腎小管上皮細胞中ECM蛋白的表達。機制與FK228抑制了TGF-β1/Smad、ERK1/2和P38 MAPK信號通路的活化有關。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R692
【部分圖文】：

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）在纖維化的進展中起關鍵作用[7]。TGF-β1是 TGF-β 家族中最常見的成員，由浸潤的炎性細胞和所有類型的腎臟細胞分泌產(chǎn)生。反過來，TGF-β1 又作用于腎臟中的許多細胞，包括足細胞、腎小管上皮細胞、巨噬細胞和 T 細胞[8]。值得注意的是，TGF-β1 以無活性的形式分泌，并與組織中的潛在TGF-β 結(jié)合蛋白（latent TGF- -binding protein，LTBP）結(jié)合。它可以很容易地被活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）等各種刺激而激活，然后以活性 TGF-β1的形式釋放出來[9]。TGF-β1 通過激活 Smad 通路和非 Smad 信號通路，誘導腎小管上皮細胞和成纖維細胞產(chǎn)生大量的 ECM 和炎性細胞因子，進一步引起腎小管間質(zhì)的損傷和炎癥，最終導致腎功能衰竭[10-12]（圖 1，Pusoon Chun，2017）。由于腎臟纖維化是一個復雜且不可逆轉(zhuǎn)的過程，盡管眾多學者們對它的發(fā)病機制進行了廣泛的研究，但目前仍然缺乏針對腎臟纖維化的有效治療方法[13, 14]。

HDAC8；（II）HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAirutin1-7；（IV）HDAC11[17]。一般來說，組蛋白去乙HDACi）有利于組蛋白乙�；腿旧|(zhì)松弛，從而是 H3 和 H4，具有多個氨基酸殘基，例如賴氨酸（L修飾，可調(diào)節(jié)基因的表達[18]。已有研究顯示 HDAC殖和凋亡及減輕血管炎癥，在腫瘤、高血壓和房顫等-25]。HDACs 的廣譜抑制劑，如伏立諾他（vorinostattatin A，TSA）能有效抑制心臟[21, 26]和肝臟[27-29]的纖的治療靶點打下了基礎。此外，HDACs 在許多腎臟，其中尤其是 HDAC1 和 HDAC2 在腎臟纖維化中處明，在 TGF-β1 誘導的腎小管上皮細胞中，HDAC1因此，若將 HDAC1 和 HDAC2 作為治療靶點，對其有效地緩解腎臟纖維化呢？

42圖 1 FK228 對 UUO 術后腎臟病理學改變的影響。（A）HE 染色檢測 UUO 術后 7小鼠腎臟的組織學變化，分別放大 100 倍和 200 倍。（B）天狼星紅染色檢測 UU后 7 天時小鼠腎臟間質(zhì)膠原纖維的沉積情況，放大 200 倍。（C）用 Image J 軟件狼星紅染色陽性（染成紅色）的面積進行半定量分析。***P<0.001 vs Sham 組，##0.001 vs UUO 組。

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2 王延葉,李榮山;TGF-β1/Smad與腎臟間質(zhì)纖維化[J];國外醫(yī)學.泌尿系統(tǒng)分冊;2005年06期

3 紀春陽;李娣昕;曾紅兵;;吡非尼酮對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟間質(zhì)纖維化的影響[J];華中科技大學學報(醫(yī)學版);2010年03期

4 周鈺松;FSP_1、腎成纖維細胞與腎臟間質(zhì)纖維化[J];瀘州醫(yī)學院學報;2002年06期

5 孫陽,鄭法雷;血管緊張素Ⅱ與腎臟間質(zhì)纖維化[J];中華內(nèi)科雜志;1999年03期

6 陳香美;腎小球疾病中腎小管間質(zhì)損害的研究進展[J];中華腎臟病雜志;2002年02期

7 程小紅;邢斌;劉建紅;趙英勇;毛加榮;張曉鳳;于小勇;;益腎散結(jié)法對大鼠腎臟間質(zhì)纖維化組織TGF-β_1和PAI-1表達的影響[J];陜西中醫(yī);2018年02期

8 毛加榮;徐薇;劉建紅;于小勇;張曉鳳;趙英勇;程小紅;;益腎散結(jié)法對UUO大鼠腎臟間質(zhì)纖維化的影響[J];陜西中醫(yī);2018年02期

9 程歡;陳星華;丁國華;;血管緊張素Ⅱ在腎間質(zhì)纖維化中的作用機制[J];中國醫(yī)藥導報;2017年02期

10 李鋒;;腎間質(zhì)纖維化發(fā)生機制的研究進展[J];中國醫(yī)藥指南;2011年35期

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3 彭志強;Intermedin通過抑制氧化應激減輕單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟間質(zhì)纖維化[D];山西醫(yī)科大學;2017年

本文編號：2810451