【摘要】：液體活組織檢查,也稱為液體活檢或液相活組織檢查,是對非固體生物組織,主要是血液的采樣和分析。與傳統(tǒng)活檢相比,液體活檢是一種非侵入性、無創(chuàng)的技術,它可以在一段時間內(nèi)頻繁的進行,能更好的跟蹤腫瘤和突變。目前液體活檢的主要檢測物包括檢測血液中游離的循環(huán)腫瘤細胞(CTCs),循環(huán)RNA(Circulating RNA),循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)碎片和外泌體(攜帶有細胞來源相關的多種蛋白質(zhì),脂類,DNA,RNA等)。外泌體在數(shù)量上多于CTCs,更容易富集,在形式上分泌的小泡能夠有效保護核酸類物質(zhì),克服了 ctDNA在血液中易降解的問題,在臨床上有廣泛的應用前景。外泌體的直徑在30-150 nm之間,是由胞吐作用釋放到細胞外的納米級細胞外脂質(zhì)雙層囊泡。它能夠?qū)⒁恍┕δ苄畔鬟f到相鄰的細胞或是較遠的細胞中,從而能夠?qū)崿F(xiàn)細胞間的通訊。由于外泌體在體液中,尤其是血液中的含量豐富及良好的穩(wěn)定性,已經(jīng)被認為是癌癥循環(huán)生物標志物的可靠來源。其所攜帶的腫瘤特異性蛋白和miRNA可以作為腫瘤診斷標志物,可用于卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌等疾病的檢測。目前,對外泌體的檢測主要基于抗體、適配體對蛋白質(zhì)的特異性識別。與抗體相比,適配體是一段DNA或RNA的序列,它能夠與目標物高特異性、高選擇性的結合,而且不易受pH、溫度等環(huán)境因素的影響。本文利用電化學方法,基于適配體與蛋白質(zhì)之間的特異性結合,實現(xiàn)了癌細胞來源的外泌體的檢測。本課題旨在建立非侵入性的癌癥檢測方法,為早期的診斷和治療提供理論依據(jù)。1.建立了一個基于適配體特異性識別,納米金顆粒負載DNA用于信號放大的電化學方法來檢測前列腺癌細胞來源的外泌體。在這個工作中,CD63核酸適配體作為探針修飾到金電極上,用于與外泌體膜上的四跨膜蛋白CD63特異性識別,使得外泌體能夠固定到金電極上。AuNPs-aptamer為金納米粒子上修飾了 CD63適配體,一方面是用于與電極上的外泌體特異性識別,使AuNPs-aptamer修飾到電極上。另一方面,AuNPs-aptamer上攜帶了大量DNA,DNA的磷酸骨架帶負電,可以吸附更多的活性物質(zhì)RuHeX,起到增強信號的作用。實驗證明,該生物傳感器對于外泌體檢測的線性范圍為9.15×104particle/mL到3.25×107 particle/mL,檢出限可以達到3.568×104 particle/mL。許多癌細胞分泌的外泌體都會攜帶四跨膜蛋白CD63,因此,我們構建的生物傳感器具有普遍的適用性,對臨床相關疾病的早期診斷具有重要的指導意義。2.建立了一個基于HCR信號放大的方法來檢測前列腺癌細胞來源的外泌體。PSMA為前列腺癌細胞的特異性蛋白,母細胞分泌的外泌體上會大量表達這種蛋白。我們設計了兩個發(fā)夾型的DNA,在引發(fā)鏈(CD63適配體的一端連接了可以引發(fā)發(fā)夾型DNA雜交的序列)的存在下,可以引發(fā)HCR。PSMA核酸適配體作為固定在電極上的探針,在目標物存在的條件下,可以與外泌體上的PSMA蛋白特異性結合,使外泌體捕獲在電極上。同時,外泌體的膜上也會表達CD63蛋白,引發(fā)鏈的一端為CD63適配體的序列,用于與外泌體上的CD63蛋白結合;另一端的序列能夠引發(fā)鏈反應,形成自主裝的DNA納米結構,這個結構能吸附更多的RuHeX到DNA的磷酸骨架上,起到信號放大的作用,使得該生物傳感器具有較高的靈敏度。
【學位授予單位】：南京師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：O657.1;R737.25
【圖文】：

不同的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在外泌體的分離和定量檢測中扮演著重要的角色。例如，逡逑外泌體膜上的四跨膜蛋白（ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１）可以提供特異性識別的位點與抗體逡逑結合。圖１．１詳細展示了外泌體的組成結構ｍ。外泌體廣泛存在于各種體液中，如血逡逑漿、血清、唾液、尿液和精液［８＿１１］。在最初的研宄中，外泌體被視為是運輸細胞不必逡逑要蛋白質(zhì)的“垃圾袋”，但后來的研[偡⑾鄭餉諤迨竅赴匾煨苑置詰哪遺藎芄喚義弦恍┕δ芐畔⒋蕕較嗔詰南赴蚴墻顯兜南赴校傭芄喚邢赴淶耐ㄑ�。母辶x舷赴置詰耐餉諤逍爍髦痔囟ǖ暮塑賬岷偷鞍字�，可視灙肿流|諏俅采系惱鋃咸徨義瞎┯屑壑檔男畔ⅰＭ餉諤蹇梢宰魑庖哂Υ鸕拇俳�，哉N乖實葜蟹⒒幼胖匾淖麇義嫌茫郟保玻擼保常蕁ＯΣ訪諤宀喚隹梢蘊匾煨緣卣攵允芴逑赴換壞鞍字屎橢�，还可译s肽勘曄苠義咸逑赴⑸匾煨緣南嗷プ饔

本文編號：2806726