【摘要】：組織激肽釋放酶相關肽酶(tissue kallikrein-related peptidases,KLKs)是一類具有胰蛋白酶和糜蛋白酶樣活性的絲氨酸蛋白酶家族,KLKs可特異性地裂解低分子量激肽原以形成激肽,后者通過選擇性地刺激緩激肽B1和B2受體進而發(fā)揮廣泛的生物學作用。本課題組前期研究指出KLK8上調誘導心肌肥厚以及進展性心功能障礙,并且這一作用是依賴于EGF及PAR1/2信號通路而并非激肽受體信號通路。與此同時,本課題組同樣發(fā)現KLK8上調誘導心肌間質纖維化,并且內皮細胞功能紊亂觸發(fā)的內皮間質轉化(Endothelial-mesenchymal transition,EndMT)參與KLK8上調介導的心肌間質纖維化的發(fā)生。糖尿病是以長期高血糖為主要特征,全身多器官系統(tǒng)病變的代謝紊亂綜合征;據統(tǒng)計,2017年全球糖尿病患者人數高達4.35億;據估計,至2045年,全球糖尿病患者人數將超過6億,糖尿病正逐漸成為全球性疾病。糖尿病如果不能夠及時診斷、治療將會引發(fā)多種并發(fā)癥,包括糖尿病心肌病、糖尿病腎病等,而后者以器官功能紊亂以及組織纖維化為主要特征。研究指出激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Kallikrein-kinin system,KKS)參與糖尿病及其并發(fā)癥的病理發(fā)生發(fā)展,然而其中的機制尚未完全闡明,那么是否KLK8參與糖尿病心肌病以及糖尿病腎病器官功能紊亂以及組織纖維化的發(fā)生呢?因此,本研究在整體水平上采用1型糖尿病小鼠模型,細胞水平上高糖處理HCAECs以及HRGECs,擬首先觀察KLK8在內皮細胞高糖處理時的表達改變,繼而利用KLK8轉基因和KLK8基因敲除兩種模式動物、通過整體和細胞水平的實驗證實KLK8在糖尿病心肌以及腎臟組織EndMT和間質纖維化病理發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵作用,并闡明其分子機制。主要實驗結果如下:第一部分KLK8促進內皮間質轉化在糖尿病心肌病心肌間質纖維化中的作用及其機制研究一.高糖顯著上調糖尿病小鼠心臟及冠脈內皮細胞KLK8表達1.(1)腹腔注射STZ構建1型糖尿病小鼠,構建成功3/6個月后檢測心臟KLK8mRNA表達,糖尿病組KLK8表達顯著高于對照組,并表現出明顯的時間依賴性;(2)人冠狀動脈內皮細胞(Human coronary artery endothelial cells,HCAECs)給與5.5mM、15mM、25mM葡萄糖處理120h,對照組給與mannitol處理;與對照組相比,高糖可顯著上調KLK8在mRNA水平表達,并表現出明顯的濃度依賴性;二.過表達KLK8誘導人冠狀動脈內皮細胞發(fā)生EndMT1.HCAECs給與KLK8腺病毒轉染72h以過表達KLK8,同空載體組相比,過表達KLK8可顯著增加間質細胞標志物α平滑肌肌動蛋白(αSMA)與波形蛋白(vimentin)蛋白表達,降低內皮細胞標志物血小板-內皮細胞黏附分子(CD31)和內皮細胞鈣粘蛋白(VE-cadherin)表達,即誘導EndMT;(2)TGF-β1中和抗體部分阻斷過表達KLK8誘導的EndMT,即抑制KLK8誘導的αSMA與vimentin表達上調以及CD31與VE-cadherin表達下調;二.KLK8上調參與高糖誘導的內皮細胞功能紊亂、EndMT以及心臟纖維化應用KLK8 siRNA以敲低內皮細胞KLK8表達,對照組給與等量control siRNA;與對照組相比,KLK8 siRNA可顯著逆轉高糖誘導的內皮細胞功能紊亂,即內皮細胞損傷標志物vWF,sTM以及E-selectin均顯著降低,內皮細胞活力顯著升高,而單獨轉染KLK8 siRNA對內皮細胞功能無影響;此外,KLK8 siRNA可顯著逆轉高糖誘導的VE-cadherin與CD31蛋白表達下調以及αSMA與vimentin蛋白上調;三.KLK8缺失可顯著減輕糖尿病心臟組織纖維化以及心臟EndMT1.KLK8缺失可顯著減輕糖尿病心臟內皮功能紊亂以及心臟功能紊亂;(1)小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)以構建1型糖尿病小鼠,模型構建成功后6個月檢測血糖水平,同野生型組相比,野生型糖尿病組血糖顯著增高,然而KLK8敲除糖尿病組小鼠血糖未見明顯降低;(2)同野生型對照組相比,糖尿病小鼠血清vWF,sTM,E-selectin均顯著升高,而KLK8缺失組糖尿病小鼠vWF,sTM,E-selectin較野生型組糖尿病小鼠顯著降低;2.KLK8缺失可顯著減輕糖尿病心臟EndMT;與野生型組相比,糖尿病小鼠心臟組織VE-cadherin和CD31表達顯著降低,αSMA和vimentin表達顯著升高,KLK8缺失可顯著逆轉高糖誘導的內皮細胞標志物降低以及間質細胞標志物增高,而單獨KLK8缺失小鼠心肌組織內皮細胞以及間質細胞標志物未見明顯改變,免疫熒光雙染結果同樣顯示,同對照組相比,野生型糖尿病小鼠心臟CD31表達顯著降低而αSMA,vimentin與fsp1表達顯著增高,并且存在大量CD31與αSMA,vimentin以及fsp1共染,而KLK8缺失可顯著增加心臟CD31表達且αSMA,vimentin與fsp1表達顯著降低;3.KLK8缺失可顯著減輕糖尿病心臟組織纖維化及心臟功能紊亂;(1)同野生型對照組相比,6個月糖尿病小鼠血壓升高、心率降低、心臟收縮功能障礙,KLK8缺失可顯著逆轉高糖誘導的血壓升高、心率降低以及心臟收縮功能障礙,而單獨KLK8缺失小鼠血壓、心率、心功能未見明顯異常;(2)Masson染色結果顯示,KLK8缺失同樣可顯著降低糖尿病心臟組織纖維化;四.KLK8降解VE-cadherin,進而促進γ-catenin發(fā)生核轉位1.KLK8過表達誘導內皮細胞損傷以及EndMT并非通過激肽B1或B2受體,而是通過其酶的活性(1)應用B1R siRNA與B2R siRNA以下調激肽B1和B2受體表達,MTT結果顯示,B1R siRNA與B2R siRNA并不能阻斷KLK8腺病毒引起的內皮細胞活力降低,不僅如此,B1R siRNA與B2R siRNA同樣不能阻斷KLK8上調引起的EndMT;(2)應用兩種蛋白酶的抑制劑:antipain與硫酸鋅以阻斷KLK8的蛋白水解作用,同對照組相比,antipain及硫酸鋅可部分阻斷KLK8誘導的內皮損傷以及EndMT,即增加內皮細胞活力,上調VE-cadherin和CD31蛋白表達,降低αSMA和vimentin蛋白表達;2.KLK8降解VE-cadherin繼而引發(fā)γ-catenin發(fā)生核轉位(1)Western blot結合N-末端測序KLK8可剪切VE-cadherin形成一個約30kDa細胞外片段;(2)腺病毒載體處理的內皮細胞γ-catenin位于細胞膜并且部分與VE-cadherin共定位,而KLK8腺病毒處理組細胞膜γ-catenin與VE-cadherin量顯著減少,并且細胞核內存在大量γ-catenin表達;不僅如此,同腺病毒載體相比,KLK8導致內皮細胞胞膜及胞漿中γ-catenin表達降低而細胞核內表達量顯著升高,而轉染VE-cadherin慢病毒可逆轉KLK8誘導的γ-catenin核轉位以及胞膜和胞漿γ-catenin表達量;五.γ-catenin參與介導KLK8誘導EndMT,而這一作用是通過與p53相互作用完成1.γ-catenin參與介導KLK8誘導EndMT應用γ-catenin siRNA以下調內皮細胞γ-catenin表達,γ-catenin siRNA可顯著逆轉KLK8誘導的內皮細胞VE-cadherin與CD31表達降低以及αSMA與vimentin的表達升高;2.γ-catenin參與介導KLK8誘導EndMT的作用是通過與p53相互作用完成(1)Co-IP結果顯示,γ-catenin在內皮細胞中與p53和TCF4相互聯系,且KLK8過表達可進一步加強γ-catenin與p53和TCF4間的結合作用;(2)p53抑制劑pifithrin-α可逆轉KLK8誘導的EndMT,然而,TCF/β-catenin通路抑制劑ICG-001不能逆轉KLK8介導的EndMT;3.TGF-β1參與介導KLK8誘導的EndMT和心臟組織纖維化(1)KLK8可顯著增加內皮細胞TGF-β1在mRNA的表達,這一作用可以被γ-catenin siRNA以及pifithrin-α部分逆轉,然而,ICG-001不能逆轉KLK8對TGF-β1的mRNA表達;(2)CHIP結果表明HIF-1α可結合到TGF-β1啟動子區(qū)的缺氧反應元件,而KLK8可進一步增強這一結合作用,HIF-1α的抑制劑echinomycin不僅能夠抑制TGF-β1的基礎表達,而且能夠阻斷KLKL8誘導的TGF-β1在內皮細胞mRNA水平的表達,γ-catenin siRNA與pifithrin-α可顯著逆轉KLK8誘導的HIF-1α與TGF-β1的結合作用;4.p53-Smad3通路參與介導KLK8誘導的EndMT以及心臟組織纖維化(1)KLK8過表達可顯著增加內皮細胞p53與Smad3的結合作用,而這一作用可被γ-catenin siRNA部分阻斷;(2)KLK8過表達可顯著增加內皮細胞TGF-β1/Smad3通路促纖維化靶基因包括Snail,Slug,Twist,Zeb1,Zeb2在mRNA水平的表達,然而γ-catenin siRNA與pifithrin-α可顯著逆轉KLK8誘導的促纖維化轉錄因子表達;六、高葡萄糖促進γ-catenin依賴性的p53與HIF-1α和Smad3相互作用,繼而以KLK8依賴性的方式增加TGF-β1/Smad3促纖維化靶基因表達1.KLK8參與高葡萄糖誘導的γ-catenin核轉位及TGF-β1依賴性促纖維化通路激活(1)高葡萄糖處理導致內皮細胞胞膜及胞漿中γ-catenin表達顯著降低,細胞核中γ-catenin表達明顯升高,然而KLK8 siRNA可降低細胞核且增加胞膜和胞漿中γ-catenin含量;(2)高葡萄糖處理導致TGF-β1 mRNA表達及釋放顯著增加,與此同時TGF-β1/Smad3通路促纖維化靶基因mRNA表達同樣明顯增加,然而KLK8siRNA與γ-catenin siRNA可以很大程度上逆轉高葡萄糖所誘導的TGF-β1/Smad3通路促纖維化靶基因表達。2.KLK8參與介導高糖誘導的γ-catenin依賴性p53與Smad3、HIF-1α的相互作用(1)高葡萄糖可導致內皮細胞γ-catenin與p53間聯系明顯加強,然而KLK8siRNA可顯著逆轉γ-catenin與p53間相互聯系。不僅如此,KLK8 siRNA與γ-catenin siRNA同樣能夠逆轉高葡萄糖誘導的內皮細胞p53與HIF-1α和Smad3間的相互作用。CHIP結果顯示:高葡萄糖能夠進一步加強HIF-1α與TGF-β1啟動子區(qū)缺氧反應元件的結合作用,然而KLK8 siRNA,γ-catenin siRNA及p53抑制劑可顯著逆轉高糖誘導的HIF-1α與TGF-β1啟動子的結合作用;(2)在整體水平上,我們發(fā)現STZ誘導的1型糖尿病小鼠在24周時心臟TGF-β1 mRNA與蛋白水平及TGF-β1/Smad3通路促纖維化靶基因表達均顯著增加,而KLK8缺失可顯著逆轉糖尿病心臟TGF-β1 mRNA與蛋白水平及TGF-β1/Smad3通路促纖維化靶基因表達的增加;(3)KLK8缺失可顯著逆轉糖尿病心臟γ-catenin與p53間相互聯系,KLK8缺失同樣可以逆轉糖尿病心臟p53與HIF-1α和Smad3間的相互作用。整體水平的CHIP結果顯示,同野生型組相比,KLK8缺失可顯著逆轉HIF-1α與TGF-β1啟動子區(qū)的結合作用。結論:高糖促進心肌組織KLK8表達,進而通過誘導心臟內皮細胞功能紊亂觸發(fā)的EndMT導致心臟間質纖維化、心臟功能紊亂,而這一作用是依賴于KLK8作用于VE-cadherin-γ-catenin復合體,VE-cadherin被降解,γ-catenin發(fā)生核轉位,進而激活TGF-β信號通路來完成。第二部分KLK8促進內皮間質轉化在糖尿病腎病腎臟間質纖維化中的作用及其機制研究一.轉基因KLK8大鼠腎臟組織發(fā)生End MT以及纖維化1.KLK8過表達導致腎臟組織纖維化和腎臟損傷Masson染色結果顯示:轉基因KLK8大鼠腎臟組織較之同齡野生型相比出現明顯的膠原堆積,并且表現出明顯的時間依賴性,即12周齡轉基因KLK8大鼠腎臟組織膠原堆積明顯多于6周齡;并且腎臟組織中羥脯氨酸和膠原蛋白及TGF-β1水平較對照組明顯升高;尿蛋白檢測結果同樣顯示轉基因KLK8大鼠較之同齡野生型相比尿蛋白含量明顯增加,并且均表現出明顯的時間依賴性;2.KLK8過表達導致腎臟組織發(fā)生End MT同野生型大鼠相比,轉基因KLK8大鼠腎臟組織vimentin和α-SMA表達顯著增加,而VE-cadherin和CD31表達顯著降低;進一步免疫熒光雙染技術結果表明:較之同齡野生型大鼠相比,12周齡轉基因KLK8大鼠腎臟組織內皮細胞標志物CD31表達顯著降低,而間質細胞標志物α-SMA、fsp1顯著增多,并且存在大量與CD31共染的陽性細胞,共聚焦結果同樣證實轉基因KLK8大鼠腎臟組織CD31與α-SMA、fsp1存在共定位;3.過表達KLK8導致人腎小球內皮細胞功能紊亂KLK8腺病毒轉染人腎小球內皮細胞(Human glomerular endothelial cells,HRGECs)以過表達KLK8,KLK8可導致內皮細胞活力顯著下降,并表現出時間和濃度依賴性,不僅如此,內皮損傷的標志物E-selectin,s TM,v WF的釋放量明顯增加,并且內皮細胞通透性顯著增加;4.過表達KLK8誘導HRGECs發(fā)生EndMTKLK8可劑量依賴性地增加αSMA與vimentin蛋白表達,降低CD31與VE-cadherin表達;二.KLK8上調參與高糖誘導的內皮細胞功能紊亂、End MT以及腎臟間質纖維化1.KLK8上調參與高糖誘導的內皮細胞功能紊亂應用KLK8 si RNA以敲低內皮細胞KLK8表達,MTT結果表明KLK8 si RNA可顯著逆轉高糖誘導的內皮細胞功能紊亂,而單獨轉染KLK8 si RNA對內皮細胞功能無影響;2.KLK8上調參與高糖誘導的End MT同對照組相比,高糖可顯著上調αSMA與vimentin蛋白的表達,降低VE-cadherin與CD31蛋白表達,而KLK8 si RNA可降低高糖誘導的αSMA與vimentin上調以及VE-cadherin與CD31下調;三.γ-catenin參與介導KLK8誘導End MT(1)γ-catenin si RNA可顯著逆轉KLK8誘導的內皮細胞VE-cadherin與CD31表達降低以及αSMA與vimentin的表達升高;此外,γ-catenin si RNA可同樣逆轉KLK8誘導的內皮細胞活力降低;(2)KLK8可顯著增加內皮細胞TGF-β1在m RNA水平的表達,這一作用可以被γ-catenin si RNA部分逆轉;(3)CHIP方法證實HIF-1α可結合到TGF-β1啟動子區(qū)的缺氧反應元件,而KLK8可進一步增強這一結合作用,且HIF1-α抑制劑可逆轉KLK8上調內皮細胞TGF-β1在m RNA水平的表達;結論:高糖促進腎臟組織KLK8表達,進而通過誘導心臟內皮細胞功能紊亂、End MT導致腎臟間質纖維化、腎臟功能紊亂,而這一作用是依賴于KLK8激活TGF-β信號通路來完成。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R587.2;R692.9
【圖文】：

STZ組小鼠血糖顯著高于對照組（A），而且糖尿病小鼠6個月時心臟出現明顯的纖維化（B）。圖1. 糖尿病小鼠血糖及心臟組織纖維化的情況。檢測小鼠血糖(A)及心臟組織纖維化(B)；** P<0.01 vs Control;Figure1. Blood glucose and cardiac fibrosis in diabetic mice. The blood glucoseconcentration (A) and level of cardiac fibrosis（B）in diabetic mice were measured. Datawere showed as mean±SEM (n=7).** P<0.01 vs WT;（二）糖尿病小鼠心臟出現 EndMT如前所述，EndMT參與糖尿病心臟纖維化的病理發(fā)生過程，因此我們檢測內皮細胞標志物VE-cadherin與CD31及間質細胞標志物αSMA與Vimentin蛋白表達。如圖2所示，糖尿病小鼠心臟VE-cadherin與CD31蛋白表達顯著降低，而αSMA與Vimentin蛋白表達顯著增高。

圖2.糖尿病小鼠心臟VE-cadherin與CD31及αSMA與Vimentin蛋白表達；WB檢測心臟VE-cadherin與CD31以及αSMA與Vimentin在蛋白質水平的表達（B）；Figure2. The protein expression of VE-cadherin and CD31 and αSMA and Vimentin indiabetic mice heart. The protein expression of VE-cadherin and CD31 and αSMA andVimentin in diabetic mice heart were measured by WB (A).（二）高糖對心臟及內皮細胞 KLK8 表達的影響本課題組前期研究顯示：在高血壓以及壓力超負荷心臟疾病大鼠模型中，心臟KLK8的表達顯著升高；那么，高糖是否同樣可以上調KLK8表達呢？因此應用高糖處理HCAECs檢測內皮細胞KLK8表達，結果表明：同對照組相比，高糖可顯著上調心臟(A)及內皮細胞KLK8在mRNA水平(B)的表達，并表現出明顯的時間和濃度依賴性。

心臟VE-cadherin與CD31及αSMA與Vimentin蛋白表D31以及αSMA與Vimentin在蛋白質水平的表達（B）otein expression of VE-cadherin and CD31 and αSMeart. The protein expression of VE-cadherin and CDetic mice heart were measured by WB (A).高糖對心臟及內皮細胞 KLK8 表達的影響期研究顯示：在高血壓以及壓力超負荷心臟疾病大著升高；那么，高糖是否同樣可以上調KLK8表達呢？內皮細胞KLK8表達，結果表明：同對照組相比，高胞KLK8在mRNA水平(B)的表達，并表現出明顯的時

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本文編號：2802119