【摘要】：目的:腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,由于腎癌對放化療不敏感,靶向藥物治療的效果存在個體差異性,伴有靜脈癌栓的腎癌及遠處轉(zhuǎn)移腎癌的治療方法仍有待進一步的研究。本研究旨在1.通過全基因組二代測序探尋腎癌的基因突變特點,探索新的治療靶點;2.在測序結(jié)果證明腎癌中廣泛存在BRCAness現(xiàn)象的基礎(chǔ)上,研究PARP抑制劑對腎癌的作用;3.探尋腎癌細胞對PARP抑制劑產(chǎn)生藥物抵抗的機制。方法:1.對5例伴有靜脈癌栓的腎癌進行全基因組測序,并進行突變簽名分析。2.對TCGA數(shù)據(jù)庫中537例腎透明細胞癌的測序數(shù)據(jù)進行突變簽名分析。2.使用MTT增殖實驗檢測六株腎癌細胞系(786-O,RCC4,Caki-1,Caki-2,A498,ACHN)對PARP抑制劑Talazoparib,Olaparib的敏感性,分別檢測腎癌細胞系對PARP抑制劑和化療藥物卡鉑、HDAC抑制劑SAHA(vorinostat)、ATM抑制劑KU55933聯(lián)合用藥的敏感性。3.設(shè)置BRCA2突變的胰腺癌Capan-1細胞系為對照組,通過westem-blot的方法檢測實驗組腎癌細胞對53BP1-RIF1軸蛋白表達情況。4.使用免疫熒光的方法檢測腎癌細胞對PARP抑制劑聯(lián)合卡鉑作用于腎癌時DNA損傷情況及53BP1-RIF1軸蛋白表達情況。5.通過轉(zhuǎn)入過表達質(zhì)粒在腎癌細胞中過表達53BP1,觀察其對PARP抑制劑的反應(yīng)。6.使用免疫組化的方法,在500例患者的組織微陣列中研究腎癌患者中53BP1表達情況。分析53BP1表達與臨床病理指標(biāo)和預(yù)后指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果:1.對5例伴靜脈癌栓的腎癌進行全基因組測序,在原發(fā)灶及癌栓中均發(fā)現(xiàn)高AC3的突變簽名及BRCAness現(xiàn)象。對TCGA數(shù)據(jù)庫中537例腎癌標(biāo)本的測序結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)腎癌廣泛存在AC3突變簽名及BRCAness現(xiàn)象。2.腎癌細胞系對PARP抑制劑存在藥物抵抗,并且這種對PARP抑制劑的藥物抵抗不能通過與Carboplatin、SAHA、KU55933的聯(lián)合用藥而得到有效改善。3.腎癌細胞系中存在53BP1-RIF1軸失調(diào),53BP1在腎癌細胞系中普遍低表達。4.PARP抑制劑聯(lián)合卡鉑用藥,可以誘導(dǎo)腎癌細胞系產(chǎn)生DNA損傷但不能誘導(dǎo)細胞凋亡。5.過表達53BP1可以使腎癌細胞系對PARP抑制劑及卡鉑聯(lián)合用藥敏感。6.53BP1在7%左右腎癌患者中表達缺失,在14%左右腎癌患者中低表達,表達缺失和低表達組與高表達組的預(yù)后沒有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論:腎癌中廣泛存在AC3突變簽名,說明腎癌中廣泛存在BRCAness現(xiàn)象。盡管存在BRCAness現(xiàn)象,腎癌細胞系對PARP抑制劑存在抵抗,這種抗性由53BP1的缺失或低表達介導(dǎo)。盡管53BP1表達情況對腎癌患者預(yù)后沒有顯著統(tǒng)計學(xué)差異,但有可能成為PARP抑制劑在腎癌中應(yīng)用的標(biāo)記物。對于BRCAness現(xiàn)象存在,同時53BP1高表達的腎癌,PARP抑制劑的應(yīng)用潛力值得進一步探索。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.11
【圖文】：

圖１．１伴靜脈癌栓的腎細胞癌突變簽名分析結(jié)果逡逑圖為按照患者編號１－５的順序排列的ＲＣＣ伴ＶＴＴ患者的二代測序結(jié)果突變簽名逡逑（ｍｕｔａｔｉｏｎ邋ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）分析。逡逑２．２邋ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫腎透明細胞癌測序數(shù)據(jù)突變簽名分析結(jié)果逡逑基于以上的測序和分析結(jié)果，我們決定擴大分析樣木量，利用ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫逡逑的腎癌測序數(shù)據(jù)進行突變簽名分析，以驗證以上發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象。通過木次試驗，我逡逑們發(fā)現(xiàn)ＴＣＧＡ腎透明細胞癌樣本中，普遍出現(xiàn)頻率最高的“突變簽名”包括ＡＣ１，逡逑ＡＣ１２，邋ＡＣ２７和ＡＣ３。其中ＡＣ１在各類癌癥中廣泛出現(xiàn)，ＡＣ２７在部分腎癌病人樣逡逑本中出現(xiàn)。而ＡＣ３的頻率最高，它與ＤＮＡ雙鏈損傷修復(fù)過程密切相關(guān)。這一實驗逡逑的結(jié)果與前期五例癌栓測序結(jié)果相一致，再次印證了腎癌中存在的高ＡＣ３突變簽逡逑

0邋ｏ邋0＝邋0＾＝邋0邋0＝＝邋ｗ＝邋0邋ｗ邋0＾＝＝邋0邋ｗ邋0邋0邋0邋0＝邋？邋0邋0＾＝邋0邋■邋ＲＣＣ－ＶＴＴ－０４逡逑ｉＩｉ｜ｉｉｉＩＩ｜｜ｉ｜Ｉ｜Ｉｌ｜｜ｉ｜ＩＩＩＩ｜｜ＩＩｌ｜ｉ邋■邋＾０－？５逡逑１邋ｌ｜邋Ｊｉｌｌ邋Ｉ邋１１１邋Ｉ邋ＰＩ！逡逑圖１．１伴靜脈癌栓的腎細胞癌突變簽名分析結(jié)果逡逑圖為按照患者編號１－５的順序排列的ＲＣＣ伴ＶＴＴ患者的二代測序結(jié)果突變簽名逡逑（ｍｕｔａｔｉｏｎ邋ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）分析。逡逑２．２邋ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫腎透明細胞癌測序數(shù)據(jù)突變簽名分析結(jié)果逡逑基于以上的測序和分析結(jié)果，我們決定擴大分析樣木量，利用ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫逡逑的腎癌測序數(shù)據(jù)進行突變簽名分析，以驗證以上發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象。通過木次試驗，我逡逑們發(fā)現(xiàn)ＴＣＧＡ腎透明細胞癌樣本中，普遍出現(xiàn)頻率最高的“突變簽名”包括ＡＣ１，逡逑ＡＣ１２，邋ＡＣ２７和ＡＣ３。其中ＡＣ１在各類癌癥中廣泛出現(xiàn)，ＡＣ２７在部分腎癌病人樣逡逑本中出現(xiàn)。而ＡＣ３的頻率最高，它與ＤＮＡ雙鏈損傷修復(fù)過程密切相關(guān)。這一實驗逡逑的結(jié)果與前期五例癌栓測序結(jié)果相一致，再次印證了腎癌中存在的高ＡＣ３突變簽逡逑名，進一步提示了腎癌中廣?

孵育會降低檢測的靈敏度。７．使用移液管再次混合每個樣品并讀取５７０ｎｍ處的光度。逡逑２．結(jié)果逡逑２．１腎癌細胞系對ＰＡＲＰ抑制劑抵抗。逡逑為了研究ＰＡＲＰ抑制劑對腎癌細胞系的作用效果，我們選取了兩個ＰＡＲＰ抑劑，奧拉帕尼（Ｏｌａｐａｒｉｂ）和他拉唑帕尼（Ｔａｌａｚｏｐａｒｉｂ）。對六株腎癌細胞系７８６－０ＲＣＣ４，Ｃａｋｉ－ｌ，邋Ｃａｋｉ－２，Ａ４９８，ＡＣＨＮ用藥，分別設(shè)置三個時間點檢測藥物對腎細胞系的作用。實驗結(jié)果顯示，在用藥２４ｈ，４８ｈ，７２ｈ三個時間點，腎癌細胞對于奧拉帕尼，他拉唑帕尼兩個藥物單獨用藥表現(xiàn)出抵抗。這兩個藥物即便在常高的濃度１００ｕＭ時，也無法使腎癌細胞系的增殖活力降到５０％以下，實驗結(jié)見圖圖１．１，圖１．２，圖１．３。逡逑－－

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本文編號：2801017