【摘要】：背景和目的糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是終末期腎功能衰竭(endstage renal failure,ESRF)的主要病因之一。近年來眾多證據(jù)表明,巨噬細(xì)胞在腎臟內(nèi)浸潤和激活,引發(fā)炎癥因子釋放,加速了DN的發(fā)展。Bruton酪氨酸激酶,屬于非受體類酪氨酸激酶,是Tec家族成員之一。主要在髓系細(xì)胞表達(dá),例如B淋巴細(xì)胞、噬堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等。既往研究證實Btk參與了細(xì)胞分裂、增殖及調(diào)亡調(diào)控,在腫瘤、缺血-再灌注損傷及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生中起到了重要的作用。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞p Btk表達(dá)增加,Btk抑制劑可抑制高糖環(huán)境下巨噬細(xì)胞激活。NLRP3炎癥小體屬于NLRs家族,定位于細(xì)胞質(zhì),包括NLRP3、ASC、caspase-1,NLRP3通過PYD結(jié)構(gòu)域募集ASC,進(jìn)而活化caspase-1前體(45),自身裂解為活化形式的caspase-1(20),其可水解切割I(lǐng)L-1β前體為成熟形式的IL-1β。本研究擬采用體內(nèi)STZ誘導(dǎo)糖尿病模型,應(yīng)用Btk基因敲除小鼠等手段旨在明確糖尿病腎病患者中是否存在炎癥小體的表達(dá)激活,探討B(tài)ruton酪氨酸激酶對糖尿病小鼠腎臟NLRP3的調(diào)節(jié)作用,尋求新手段來改善糖尿病腎臟炎癥。方法選取SPF級C57BL/6J小鼠及健康雄性C57BL/6J全髓系細(xì)胞Btk基因敲除小鼠,腹腔注射鏈脲佐菌素50mg/kg,對照組注射相應(yīng)體積枸櫞酸鈉溶液,連續(xù)注射5天,一周后檢測血糖,血糖≥16.7mmol確定為糖尿病模型。隨機(jī)分為正常對照組,糖尿病模型組,Btk-/-對照組,Btk-/-糖尿病模型組,每組7只小鼠。血糖升高12周末收集各組小鼠血、尿和腎組織標(biāo)本,測定血糖、腎重、體重及二者比值和24小時尿白蛋白排泄率。光鏡觀察腎組織病理變化;免疫組化檢測活化的巨噬細(xì)胞(CD68+i NOS陽性細(xì)胞),NLRP3和IL-1β、TNF-α,MCP-1炎癥因子的表達(dá);激光共聚焦檢測CD68,i NOS,Btk,NLRP3的共表達(dá);western blot檢測腎組織Btk,p Btk,i NOS,NLRP3,caspase-1,ASC,IL-1β、TNF-α,MCP-1蛋白的表達(dá),實時定量PCR檢測TNF-α,MCP-1,IL-1βm RNA的表達(dá)。免疫共沉淀檢測ASC與NLRP3的相互作用。結(jié)果1.12周末糖尿病模型組小鼠血糖、腎重體重比值及24小時尿白蛋白排泄率明顯高于正常對照組(p0.05),Btk-/-糖尿病模型組小鼠腎重/體重及24小時尿白蛋白排泄率明顯低于糖尿病模型組(p0.05)。2.與12周末正常對照組小鼠相比,糖尿病模型組小鼠系膜擴(kuò)張指數(shù)和腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)評分明顯增加(p0.05),Btk-/-糖尿病模型組的病理改變明顯得到改善(p0.05)。3.免疫組化顯示12周末糖尿病模型組腎組織i NOS、NLRP3、IL-1β、TNF-α,MCP-1炎癥因子表達(dá)明顯高于正常對照組,而Btk-/-糖尿病模型組小鼠腎組織NLRP3表達(dá)明顯低于糖尿病模型組(p0.05)。4.激光共聚焦顯示糖尿病模型組腎組織CD68、i NOS、Btk、NLRP3共定位表達(dá)明顯高于正常對照組,而Btk-/-糖尿病模型組小鼠腎組織CD68、i NOS、Btk、NLRP3共定位表達(dá)明顯低于糖尿病模型組。5.Westernblot顯示12周末糖尿病模型組p Btk,i NOS、NLRP3,caspase-1,ASC,IL-1β,TNF-α,MCP-的蛋白相對表達(dá)量明顯高于正常對照組(p0.05),而Btk-/-糖尿病模型組較糖尿病模型組明顯下降(p0.05)。6.實時定量PCR結(jié)果表明糖尿病模型組小鼠腎組織TNF-α,MCP-1,IL-1βm RNA表達(dá)明顯高正常對照組(p0.05),而Btk-/-糖尿病模型組明顯低于糖尿病模型組(p0.05)。7.免疫共沉淀顯示糖尿病模型組小鼠腎組織ASC與NLRP3的結(jié)合明顯高正常對照組(p0.05),而Btk-/-糖尿病模型組二者的結(jié)合明顯低于糖尿病模型組(p0.05)。結(jié)論糖尿病小鼠腎組織p-Btk,i NOS、NLRP3,caspase-1,ASC,IL-1β、TNF-α,MCP-1的蛋白表達(dá)上調(diào)及TNF-α,MCP-1,IL-1β的基因相對表達(dá)量增加,Btk基因敲除可以下調(diào)NLRP3信號通路及炎癥因子的表達(dá),提示Btk可能通過下調(diào)NLRP3的炎性反應(yīng)從而減輕糖尿病腎臟的損害,并且可能的機(jī)制是影響了ASC與NLRP3的相互作用
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R587.2;R692.9
【圖文】：

Btk-/-小鼠腎臟及骨髓來源巨噬細(xì)胞Btk蛋白表達(dá)

注：1：Control 2:Diabetic 3:Btk-/- 4:Btk-/- diabetic與 Control 組比較：aP<0.05,與 Btk-/-組比較，bP<0.05,與 Diabetic 組比較，cP<0.05圖 3 各組小鼠 12 周腎組織病理形態(tài)改變 PAS 染色（×400）Fig 3 Renal histopathological changes of 12 weeks in each group

敲基因模型組腎組織織中活化的巨噬細(xì)胞與糖尿病模型組比較有明顯的減少，腎小球和腎小管免疫熒光表達(dá)較糖尿病模型組減弱，提示Btk基因敲除可以抑制活化的巨噬細(xì)胞在腎組織中的浸潤表達(dá)，從而可以保護(hù)腎臟。見圖4(scale bar:10um)圖 4 激光共聚焦檢測 CD68 和 iNOS 共表達(dá)Fig 4 Co-expression of CD68 and iNOS in each group by immunofluorescence

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本文編號：2789529