【摘要】：目的本研究將肝細(xì)胞生長因子激活物抑制因子-1(HAI-1)基因作為目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3細(xì)胞,通過檢測一系列自噬相關(guān)指標(biāo),觀察HAI-1基因?qū)η傲邢侔㏄C-3細(xì)胞自噬功能的影響,初步探討其發(fā)生的可能機(jī)制,為前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展提供新的理論依據(jù)。方法將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HAI-1轉(zhuǎn)染到前列腺癌PC-3細(xì)胞中,并設(shè)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1(+)empty vector為空載體組,無質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為陰性對(duì)照組。轉(zhuǎn)染72h后收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA和蛋白,以實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測HAI-1、自噬標(biāo)志物Beclin 1 mRNA表達(dá)情況,Western印跡方法檢測三組LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白比率和Beclin 1蛋白表達(dá)水平的變化,并通過透射電子顯微鏡和細(xì)胞免疫熒光觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和自噬水平。結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示,空載體組與陰性對(duì)照組相比較,前列腺癌PC-3細(xì)胞HAI-1、Beclin 1的mRNA表達(dá)并無差異,說明轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞并無影響。陰性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比較,細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HAI-1后自噬相關(guān)基因Beclin 1的mRNA表達(dá)水平明顯增強(qiáng);Western印跡結(jié)果顯示,與空載體組和陰性對(duì)照組相比較,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-HAI-1質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白比率變大,Beclin 1蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);透射電子顯微鏡觀察可見,實(shí)驗(yàn)組的前列腺癌PC-3細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有大量自噬體和自噬溶酶體,并可通過熒光顯微鏡觀測到熒光標(biāo)記的自噬體和自噬溶酶體。結(jié)論HAI-1基因可誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞發(fā)生自噬,干預(yù)前列腺癌細(xì)胞自噬活性可能是治療前列腺癌的潛在途徑。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.25
【圖文】：

圖 2 DNA 電泳檢測 HAI-1 在 PC-3 細(xì)胞中的表達(dá) 1 為空載體組；2 和 4 為陰性對(duì)照組；3 為；M 為 DNA makerAI-1 對(duì)前列腺癌 PC-3 細(xì)胞自噬的影響.Western 印跡分析Beclin 1 的表觀分子量是 60 kDa，LC3 I 的表觀分子量是 16 kDa，LC3 II 的表觀量是 14 kDa，以 β-Actin（表觀分子量為 42 kDa）作為內(nèi)參。檢測各組細(xì)胞中自噬 LC3 II/LC3 I 蛋白表達(dá)的比率以及 Beclin 1 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。Western blot 結(jié)示，與空載體組及陰性對(duì)照組相比較，前列腺癌 PC-3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒NA3.1(+)-HAI-1 后，LC3 II/LC3 I 蛋白表達(dá)的比率升高，Beclin 1 的蛋白表達(dá)明強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P < 0.05），如圖 3。

圖 3 三組自噬相關(guān)蛋白的 Western blot 結(jié)果 A：LC3 II/LC3 I 蛋白表達(dá)的比率；B：Beclin 1 的白表達(dá)（注：*兩組間比較 P < 0.05）2.細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

PC-3細(xì)胞內(nèi)自噬顆粒的觀察（電鏡，標(biāo)尺為500nm）A：實(shí)驗(yàn)組；B：陰性對(duì)照組

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本文編號(hào)：2789286