【摘要】：目的:膀胱癌是最常見的泌尿系惡性腫瘤之一。由于對(duì)膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制缺乏準(zhǔn)確的認(rèn)知,目前膀胱癌的臨床治療手段仍十分有限。因此,深入研究膀胱癌發(fā)生及進(jìn)展的分子機(jī)制有助于探索膀胱癌治療的新靶標(biāo),實(shí)現(xiàn)膀胱癌的精準(zhǔn)治療。甲狀腺激素受體互作蛋白13(thyroid hormone receptor interactor 13,TRIP13)在有絲分裂的紡錘體組裝檢查點(diǎn)和DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)中起到重要的作用。近年來,研究發(fā)現(xiàn)TRIP13在多種腫瘤中均異常表達(dá)且其表達(dá)水平與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。然而,TRIP13與膀胱癌的關(guān)系目前尚未見詳細(xì)報(bào)道。因此,本課題擬探討TRIP13在膀胱癌及癌旁組織內(nèi)的表達(dá)量差異,分析TRIP13表達(dá)量與膀胱癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性。研究敲減TRIP13表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡及轉(zhuǎn)移能力的影響。探究TRIP13在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制,為膀胱癌的分子機(jī)理和治療策略提供理論依據(jù)。方法:1.對(duì)含有46例膀胱癌組織及配對(duì)癌旁組織的組織芯片進(jìn)行免疫組化染色,分析TRIP13蛋白表達(dá)水平在癌組織內(nèi)的改變。2.通過公共數(shù)據(jù)庫Oncomine分析TRIP13在多種腫瘤內(nèi)的表達(dá)情況。檢索Oncomine和TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫內(nèi)的膀胱癌相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析TRIP13在膀胱癌中的表達(dá)水平。3.對(duì)342例膀胱癌患者的腫瘤組織石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色并分析TRIP13表達(dá)量與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。4.通過對(duì)公共數(shù)據(jù)庫GEO(Gene Expression Omnibus)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘并選取GSE13507數(shù)據(jù)集來分析TRIP13表達(dá)量與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系。5.在細(xì)胞水平:通過qRT-PCR檢測(cè)6株膀胱癌細(xì)胞(T24、5637、HT-1197、TCCSUP、ScaBER及J82)內(nèi)TRIP13的mRNA表達(dá)量。通過構(gòu)建靶向TRIP13的干擾RNA慢病毒來敲減TRIP13在膀胱癌細(xì)胞T24和5637內(nèi)的表達(dá)。以MTT實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)分析、劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell遷移實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)TRIP13敲減對(duì)膀胱癌細(xì)胞T24及5637的增殖、克隆形成能力、細(xì)胞周期、凋亡和細(xì)胞遷移能力的影響。通過Western blot檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白來探索TRIP13是否參與膀胱癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。6.在動(dòng)物水平:以靶向TRIP13的干擾RNA慢病毒實(shí)現(xiàn)對(duì)T24細(xì)胞中TRIP13的穩(wěn)定敲減,并以該穩(wěn)轉(zhuǎn)株建立膀胱癌裸鼠皮下成瘤模型來探索TRIP13對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖能力的影響。7.TRIP13在膀胱癌中的作用機(jī)制分析:通過分析TRIP13敲減組與對(duì)照組T24細(xì)胞的全基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)并用IPA軟件分析差異表達(dá)基因,研究TRIP13參與膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制�；谛酒慕Y(jié)果,選取若干與腫瘤形成密切相關(guān)的基因進(jìn)行qRT-PCR及Western blot驗(yàn)證。在T24細(xì)胞中過表達(dá)Flag-TRIP13,通過免疫沉淀聯(lián)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定TRIP13的互作蛋白。根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果,選取若干蛋白進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證TRIP13的互作蛋白,并在膀胱癌樣本中驗(yàn)證臨床相關(guān)性。結(jié)果:1.組織芯片的免疫組化結(jié)果顯示TRIP13在膀胱癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁組織:我們?cè)?0例(21.7%)癌組織內(nèi)檢測(cè)到TRIP13的高表達(dá)而在正常的癌旁組織內(nèi)僅有1例(2.2%)為TRIP13高表達(dá)。2.Onomine數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示TRIP13在20種腫瘤中均有異常高表達(dá)。在納入的448例研究中,70例結(jié)果均顯示TRIP13在癌組織內(nèi)的表達(dá)高于癌旁正常組織(設(shè)定的倍數(shù)變化臨界值為2)。通過對(duì)Oncomine和TCGA數(shù)據(jù)庫內(nèi)的膀胱癌數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,我們發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比,膀胱癌組織內(nèi)的TRIP13表達(dá)量明顯增高。3.342例膀胱癌患者腫瘤組織的免疫組化染色結(jié)果表明,TRIP13的表達(dá)量與年齡、性別、腫瘤大小無明顯相關(guān)性,但與AJCC(American Joint Committee on Cancer)高分期,淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。4.對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫內(nèi)的數(shù)據(jù)集GSE13507進(jìn)行Kaplan-Meier單因素生存分析,結(jié)果顯示高表達(dá)TRIP13膀胱癌患者總生存時(shí)間(68.0月)明顯低于TRIP13低表達(dá)患者(96月,P0.01);高表達(dá)TRIP13膀胱癌患者疾病特異性生存時(shí)間(94.0月)明顯低于TRIP13低表達(dá)患者(123.9月,P0.001)。并且在非肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌中,高表達(dá)TRIP13膀胱癌患者總生存時(shí)間(78.7月)明顯低于TRIP13低表達(dá)患者(103.0月,P0.05)。然而COX多因素生存分析顯示,TRIP13并不能作為膀胱癌患者的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素。5.qRT-PCR結(jié)果顯示TRIP13在膀胱癌細(xì)胞T24、5637、HT-1197、TCCSUP、ScaBER及J82中均有表達(dá)。靶向TRIP13的干擾RNA慢病毒轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞T24及5637后,TRIP13的表達(dá)量明顯下降。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,TRIP13敲減組細(xì)胞增殖速度受到顯著抑制。克隆形成實(shí)驗(yàn)中,TRIP13敲減組形成的克隆數(shù)目明顯少于對(duì)照組,TRIP13敲減抑制了T24及5637細(xì)胞的克隆形成能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,敲減TRIP13導(dǎo)致T24及5637的細(xì)胞周期阻滯于G2/M期并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell遷移實(shí)驗(yàn)中,敲減TRIP13后,T24及5637細(xì)胞的遷移能力較對(duì)照組有顯著下降。Western blot結(jié)果顯示TRIP13敲減組上皮化指標(biāo)E-caherin的表達(dá)明顯升高,間質(zhì)化指標(biāo)fibronectin和vimentin的表達(dá)明顯降低。6.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照組10只小鼠均有腫瘤形成,而在TRIP13敲減組中僅有9只小鼠有可探及的腫瘤形成。TRIP13敲減組腫瘤體積的增長(zhǎng)速度明顯慢于對(duì)照組。小動(dòng)物活體成像數(shù)據(jù)顯示,對(duì)照組腫瘤的熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯強(qiáng)于TRIP13敲減組。在腫瘤凈重上,TRIP13敲減組顯著小于對(duì)照組。7.對(duì)比分析TRIP13敲減組與對(duì)照組T24細(xì)胞的全基因表達(dá)芯片結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)敲減TRIP13導(dǎo)致1175個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生顯著性變化,其中588個(gè)發(fā)生上調(diào),587個(gè)發(fā)生下調(diào)。Gene Ontology分析結(jié)果顯示,敲減TRIP13的表達(dá)后“間質(zhì)化發(fā)展”這一生物學(xué)功能受到明顯抑制,且差異表達(dá)基因的細(xì)胞定位集中于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,細(xì)胞核膜和胞質(zhì)微管。為了進(jìn)一步證實(shí)芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們以qRT-PCR和Western blot檢測(cè)了TRIP13敲減后數(shù)個(gè)腫瘤形成相關(guān)基因的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示多個(gè)EGFR通路內(nèi)的關(guān)鍵基因(ID1、Cox-2、Slug和EGFR)的mRNA和蛋白表達(dá)水平在TRIP13敲減后均有顯著下降。此外,經(jīng)典通路分析結(jié)果顯示,差異基因富集度排名前15的通路中,有7條通路均與EGFR信號(hào)通路相關(guān)。液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜鑒定出共計(jì)2476種蛋白為TRIP13的潛在互作蛋白,其中包括多個(gè)EGFR通路內(nèi)的關(guān)鍵蛋白,如EGFR、JAK2和AKT1。根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果,我們進(jìn)行了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證TRIP13能否與EGFR、JAK2或AKT1相互作用。結(jié)果顯示,EGFR與TRIP13存在相互作用。對(duì)GSE13507的數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,結(jié)果表明TRIP13與EGFR的表達(dá)量存在相關(guān)性(P0.001)。Kaplan-Meier單因素生存分析結(jié)果顯示TRIP13和EGFR均高表達(dá)膀胱癌患者的總生存時(shí)間(71.7月)明顯低于二者均低表達(dá)的患者(100.3月,P=0.016);TRIP13和EGFR均高表達(dá)膀胱癌患者的疾病特異性生存時(shí)間(95.1月)明顯低于二者均低表達(dá)的患者(125.4月,P=0.013)。結(jié)論:TRIP13在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯高于正常膀胱組織,且其表達(dá)水平與AJJCC高分期、淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān),TRIP13的高表達(dá)預(yù)示著膀胱癌患者不良的預(yù)后,提示TRIP13可以作為膀胱癌疾病進(jìn)展及預(yù)后的一個(gè)生物標(biāo)記物。TRIP13在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制可能為通過與EGFR互作來調(diào)控EGFR信號(hào)通路及一系列下游信號(hào)通路,最終影響增殖、細(xì)胞周期、凋亡及遷移等生物學(xué)功能。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.14
【圖文】：

學(xué)博士學(xué)位論文 TRIP13 對(duì)膀胱癌P13 在膀胱癌組織中高表達(dá)癌組織芯片中包含 46 例膀胱癌患者的癌組織及配對(duì)的癌旁正常組織 10 例（21.7%）高表達(dá) TRIP13，而在配對(duì)的癌旁正常組織中僅有 1RIP13。TRIP13 蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織（。圖 2-1-b 為典型的癌組織及癌旁組織免疫組化染色結(jié)果（T：腫瘤組織）。

2-2 TRIP13 在腫瘤公共數(shù)據(jù)庫 Oncomine 及 TCGA 內(nèi)的表達(dá)情況。（a）TRIP13 在 20 種腫瘤存在異常高表達(dá)。紅色為高表達(dá)，藍(lán)色為低表達(dá)。（b）TRIP13 在兩個(gè)獨(dú)立研究中（Lee et al., n= Sanchez-Carbayo et al., n=256） 的表達(dá)情況。NU：正常尿路上皮組織；SUP：淺表性膀胱癌組V：肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌組織。 **， P < 0.01。（c）TCGA 膀胱癌數(shù)據(jù)庫中 TRIP13 mRNA 的表情況。.3 討論惡性腫瘤是威脅人類健康的全球性醫(yī)療衛(wèi)生問題。腫瘤診療的合理規(guī)劃能夠有效少對(duì)社會(huì)公共衛(wèi)生資源的浪費(fèi)。為了提高腫瘤患者診療的效率，精準(zhǔn)醫(yī)療或稱為個(gè)醫(yī)療應(yīng)運(yùn)而生。腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)療旨在通過對(duì)大樣本人群的組學(xué)大數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息析以闡明疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制并結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)和免疫狀態(tài)方面因素對(duì)疾病進(jìn)行精確分類，以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定患者的個(gè)體化精準(zhǔn)治療，降低醫(yī)療資無效投入，提高疾病診治的效率與效益[19]。它的發(fā)展是基因組學(xué)、蛋白組學(xué)以及生息學(xué)等學(xué)科不斷發(fā)展與相關(guān)技術(shù)產(chǎn)業(yè)革新突破的結(jié)果[20]。膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最為常惡性腫瘤。近 10 年間隨著工業(yè)化的進(jìn)程及環(huán)境污染的加重，我國(guó)膀胱癌的發(fā)病率亡率呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[2]，對(duì)膀胱癌的精準(zhǔn)醫(yī)療提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

州大學(xué)博士學(xué)位論文 TRIP13 對(duì)膀胱癌的作續(xù)表 3-2 COX 風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析總生存率 疾病特異性生存率HR（95%CI） P HR（95%CI） P分析3.973（2.120-7.445） 0.000* 4.329（1.621-11.556） 0.003*潤(rùn) 1.922（1.000-3.696） 0.050 15.053（3.859-58.716） 0.000*級(jí) 1.086（0.590-2.001） 0.790 1.102（0.460-2.639） 0.828移 2.482（0.988-6.235） 0.053 2.802（1.108-7.086） 0.030*移 5.724（1.830-17.906） 0.003* 4.414（1.251-15.582） 0.021*3 1.359（0.778-2.375） 0.281 1.486（0.604-3.657） 0.388hazard ratio，風(fēng)險(xiǎn)比；CI：confidence interval，可信區(qū)間

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