發(fā)布時間：2020-08-07 16:41

【摘要】：目的 富含胱氨酸蛋白61(cysteine-rich protein 61,Cyr61)是一種富含半胱氨酸的具備肝素聯(lián)結(jié)活性的分泌蛋白,主要調(diào)理細胞外基質(zhì)生成、細胞增生、分化、凋亡等重要的生物進程。缺血再灌注性急性腎損傷(IR-AKI)所致的腎纖維化中,腎間質(zhì)成纖維細胞的異樣激活發(fā)揮重要作用,而已有研究顯示Cyr61在腎組織缺血早期高表達。因此,我們檢測IR-AKI后腎纖維化及腎成纖維細胞中Cyr61的表達量,并探究Cyr61對腎成纖維細胞的影響及相關(guān)機制。方法 (1)制備IR-AKI后腎纖維化的大鼠模型,采用生化檢測和組織病理切片Masson染色方法評估大鼠腎功能及纖維化,Western蛋白印跡試驗半定量分析Cyr61蛋白表達變化。(2)利用生物信息學分析缺血再灌注腎臟活化的成纖維細胞中Cyr61的表達情況。(3)TGF-β1(梯度濃度0、0.5、1、2、5μg/L)誘導激活正常大鼠腎臟成纖維細胞株(NRK-49F細胞)48 h,CCK8方法檢測細胞增殖活性,Western蛋白印跡試驗半定量分析Cyr61蛋白水平。(4)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NRK-49F細胞,分為:空白組、對照組(空載質(zhì)粒組)、Cyr61~+組/Cyr61~(--)組(過表達Cyr61質(zhì)粒組/低表達Cyr61質(zhì)粒組)。NRK-49F細胞被過表達Cyr61質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后,采用CCK8試驗測定細胞增生能力。(5)5μg/L TGF-β1刺激及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞48h,將細胞分為:對照組、活化組、Cyr61~+組/Cyr61~(--)組、Cyr61~+活化組/Cyr61~(--)活化組。通過CCK8試驗測定細胞增殖活性,通過流式細胞檢測法分類細胞周期,通過PCR試驗分析Cyr61、纖維化相關(guān)因子(膠原蛋白Col1α1與Col3α1、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9與MMP13)以及衰老信號途徑(p53/p21途徑與p16/Rb1途徑)相關(guān)因子的基因轉(zhuǎn)錄情況,通過Western蛋白印跡試驗半定量分析Cyr61、Col3、MMP9蛋白的變化。結(jié)果 (1)在IR-AKI后腎臟纖維化過程中,膠原纖維在AKI后1W腎臟中表達最明顯,而Cyr61蛋白此時處于最低水平(P0.05);(2)生物信息學基因芯片數(shù)據(jù)分析顯示Cyr61在缺血再灌注后3天腎成纖維細胞中表達降低(P0.05)。(3)與對照組相比,TGF-β1梯度濃度活化的NRK-49F細胞的增殖活性均增加,而Cyr61蛋白水平于1μg/L組降低,5μg/L組升高(P0.05);(4)對比對照組,過表達Cyr61質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后細胞的增殖能力均降低,且呈時間依賴性;(5)Cyr61能降低NRK-49F細胞膠原纖維Col1α1 mRNA、Col3α1 mRNA的轉(zhuǎn)錄,降低Col3蛋白的水平,同時Cyr61能增加基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9 mRNA、MMP13 mRNA的轉(zhuǎn)錄,提高MMP9蛋白的表達水平;(6)Cyr61可以抑制NRK-49F細胞的增生能力,促進細胞留滯于G1期,促進細胞衰老途徑相關(guān)因子p53、p21和Rb的轉(zhuǎn)錄。結(jié)論 Cyr61不僅可以抑制體外實驗中成纖維細胞的纖維化細胞表型,還可能通過p53/p21/Rb相關(guān)的細胞衰老信號途徑,促進腎成纖維細胞留滯于G1細胞周期、抑制細胞增生能力,進而影響IR-AKI后腎纖維化的過程。
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R692
【圖文】：

結(jié)果2 生物信息學分析顯示 Cyr61 在 IR 后 3 天激活的腎成纖維細胞中低達。從 GEO 數(shù)據(jù)庫 GP1261 基因芯片平臺獲得 GSE62732 芯片 8 個樣本，其中正常腎成纖維細胞 3 個樣本和缺血再灌注 45min 所致急性腎損傷后 3 天的腎成細胞 5 個樣本。RNA 降解曲線和 NUSE 箱線圖評估顯示 GSM1532545 樣本芯合格（圖 2A 和 2B）。排除后的數(shù)據(jù)分析顯示，Cyr61 在 IR 后 3 天激活的腎成細胞中的基因轉(zhuǎn)錄顯著下降，差別具備統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖 2C 和 2D）。結(jié)果提示 Cyr61 可能與激活的腎成纖維細胞存在一定的相關(guān)性。A. B.RNA 降解曲線NUSE 箱線圖

5μg/L TGF-β1 均明顯增加 Cyr61 蛋白的表達量（P<0.01）。TGF-β1 誘導下 NRK-49F 細胞的增殖活性與 Cyr61 蛋白表達的這種相反趨勢（圖3D），提示 Cyr61 可能在某種程度上抑制細胞增生活性。本研究也觀察到細胞高表達的 Cyr61 蛋白（5μg/L TGF-β1 組）并不足夠降低 NRK-49F 細胞的增生能力、不能逆轉(zhuǎn)細胞的活化狀態(tài)，這可能是細胞自身 Cyr61 蛋白的表達量受限所造成的。后續(xù)我們通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法制備呈現(xiàn) Cyr61 不同水平的腎成纖維細胞，以求進一步探索 Cyr61 的作用及機制。A1B注：對比 0μg/L TGF-β1 組，*p<0.05，***p<0.001；對比 1μg/L TGF-β1 組，#p<0.05，##p<0.01TGF-β1 的濃度（μg/L）

青島大學碩士學位論文4 過表達 Cyr61 以時間依賴性方式抑制 NRK-49F 細胞的增生能力。NRK-49F 細胞分為空白組、對照組（空載質(zhì)粒組）、Cyr61+組（過表達 Cyr61質(zhì)粒組）。 PCR 分析顯示，與空白組及對照組比較，Cyr61+組細胞 Cyr61 mRNA顯著高表達（p<0.001，圖 4A），達 4000 倍左右，而空白組與對照組對比無統(tǒng)計學意義。Western 半定量分析亦顯示，Cyr61+組細胞 Cyr61 蛋白表達較空白組及對照組為高水平（p<0.01，圖 4B 和 4C），而空白組與對照組對比無統(tǒng)計學意義。CCK8結(jié)果顯示，在相同轉(zhuǎn)染時間下，與空白組和對照組對比，Cyr61+組的增殖活性明顯受到抑制（均 p <0.01，圖 4D），而空白組及對照質(zhì)粒組的細胞增殖變化均無統(tǒng)計學意義。與 Cyr61+質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 24h 相比，轉(zhuǎn)染 48h 時細胞增生能力受到顯著抑制，轉(zhuǎn)染 72h 對細胞損傷更為嚴重，細胞活性大約僅為同時間段對照組的 25%（均 p<0.05，圖 4D）。后續(xù)實驗中我們選用 48h 作為最佳轉(zhuǎn)染時間點。A. B.

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