【摘要】：目的 富含胱氨酸蛋白61(cysteine-rich protein 61,Cyr61)是一種富含半胱氨酸的具備肝素聯(lián)結(jié)活性的分泌蛋白,主要調(diào)理細(xì)胞外基質(zhì)生成、細(xì)胞增生、分化、凋亡等重要的生物進(jìn)程。缺血再灌注性急性腎損傷(IR-AKI)所致的腎纖維化中,腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的異樣激活發(fā)揮重要作用,而已有研究顯示Cyr61在腎組織缺血早期高表達(dá)。因此,我們檢測(cè)IR-AKI后腎纖維化及腎成纖維細(xì)胞中Cyr61的表達(dá)量,并探究Cyr61對(duì)腎成纖維細(xì)胞的影響及相關(guān)機(jī)制。方法 (1)制備IR-AKI后腎纖維化的大鼠模型,采用生化檢測(cè)和組織病理切片Masson染色方法評(píng)估大鼠腎功能及纖維化,Western蛋白印跡試驗(yàn)半定量分析Cyr61蛋白表達(dá)變化。(2)利用生物信息學(xué)分析缺血再灌注腎臟活化的成纖維細(xì)胞中Cyr61的表達(dá)情況。(3)TGF-β1(梯度濃度0、0.5、1、2、5μg/L)誘導(dǎo)激活正常大鼠腎臟成纖維細(xì)胞株(NRK-49F細(xì)胞)48 h,CCK8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,Western蛋白印跡試驗(yàn)半定量分析Cyr61蛋白水平。(4)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NRK-49F細(xì)胞,分為:空白組、對(duì)照組(空載質(zhì)粒組)、Cyr61~+組/Cyr61~(--)組(過(guò)表達(dá)Cyr61質(zhì)粒組/低表達(dá)Cyr61質(zhì)粒組)。NRK-49F細(xì)胞被過(guò)表達(dá)Cyr61質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后,采用CCK8試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增生能力。(5)5μg/L TGF-β1刺激及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h,將細(xì)胞分為:對(duì)照組、活化組、Cyr61~+組/Cyr61~(--)組、Cyr61~+活化組/Cyr61~(--)活化組。通過(guò)CCK8試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖活性,通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)法分類細(xì)胞周期,通過(guò)PCR試驗(yàn)分析Cyr61、纖維化相關(guān)因子(膠原蛋白Col1α1與Col3α1、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9與MMP13)以及衰老信號(hào)途徑(p53/p21途徑與p16/Rb1途徑)相關(guān)因子的基因轉(zhuǎn)錄情況,通過(guò)Western蛋白印跡試驗(yàn)半定量分析Cyr61、Col3、MMP9蛋白的變化。結(jié)果 (1)在IR-AKI后腎臟纖維化過(guò)程中,膠原纖維在AKI后1W腎臟中表達(dá)最明顯,而Cyr61蛋白此時(shí)處于最低水平(P0.05);(2)生物信息學(xué)基因芯片數(shù)據(jù)分析顯示Cyr61在缺血再灌注后3天腎成纖維細(xì)胞中表達(dá)降低(P0.05)。(3)與對(duì)照組相比,TGF-β1梯度濃度活化的NRK-49F細(xì)胞的增殖活性均增加,而Cyr61蛋白水平于1μg/L組降低,5μg/L組升高(P0.05);(4)對(duì)比對(duì)照組,過(guò)表達(dá)Cyr61質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后細(xì)胞的增殖能力均降低,且呈時(shí)間依賴性;(5)Cyr61能降低NRK-49F細(xì)胞膠原纖維Col1α1 mRNA、Col3α1 mRNA的轉(zhuǎn)錄,降低Col3蛋白的水平,同時(shí)Cyr61能增加基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9 mRNA、MMP13 mRNA的轉(zhuǎn)錄,提高M(jìn)MP9蛋白的表達(dá)水平;(6)Cyr61可以抑制NRK-49F細(xì)胞的增生能力,促進(jìn)細(xì)胞留滯于G1期,促進(jìn)細(xì)胞衰老途徑相關(guān)因子p53、p21和Rb的轉(zhuǎn)錄。結(jié)論 Cyr61不僅可以抑制體外實(shí)驗(yàn)中成纖維細(xì)胞的纖維化細(xì)胞表型,還可能通過(guò)p53/p21/Rb相關(guān)的細(xì)胞衰老信號(hào)途徑,促進(jìn)腎成纖維細(xì)胞留滯于G1細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增生能力,進(jìn)而影響IR-AKI后腎纖維化的過(guò)程。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R692
【圖文】：

結(jié)果2 生物信息學(xué)分析顯示 Cyr61 在 IR 后 3 天激活的腎成纖維細(xì)胞中低達(dá)。從 GEO 數(shù)據(jù)庫(kù) GP1261 基因芯片平臺(tái)獲得 GSE62732 芯片 8 個(gè)樣本，其中正常腎成纖維細(xì)胞 3 個(gè)樣本和缺血再灌注 45min 所致急性腎損傷后 3 天的腎成細(xì)胞 5 個(gè)樣本。RNA 降解曲線和 NUSE 箱線圖評(píng)估顯示 GSM1532545 樣本芯合格（圖 2A 和 2B）。排除后的數(shù)據(jù)分析顯示，Cyr61 在 IR 后 3 天激活的腎成細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄顯著下降，差別具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖 2C 和 2D）。結(jié)果提示 Cyr61 可能與激活的腎成纖維細(xì)胞存在一定的相關(guān)性。A. B.RNA 降解曲線NUSE 箱線圖

5μg/L TGF-β1 均明顯增加 Cyr61 蛋白的表達(dá)量（P<0.01）。TGF-β1 誘導(dǎo)下 NRK-49F 細(xì)胞的增殖活性與 Cyr61 蛋白表達(dá)的這種相反趨勢(shì)（圖3D），提示 Cyr61 可能在某種程度上抑制細(xì)胞增生活性。本研究也觀察到細(xì)胞高表達(dá)的 Cyr61 蛋白（5μg/L TGF-β1 組）并不足夠降低 NRK-49F 細(xì)胞的增生能力、不能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的活化狀態(tài)，這可能是細(xì)胞自身 Cyr61 蛋白的表達(dá)量受限所造成的。后續(xù)我們通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法制備呈現(xiàn) Cyr61 不同水平的腎成纖維細(xì)胞，以求進(jìn)一步探索 Cyr61 的作用及機(jī)制。A1B注：對(duì)比 0μg/L TGF-β1 組，*p<0.05，***p<0.001；對(duì)比 1μg/L TGF-β1 組，#p<0.05，##p<0.01TGF-β1 的濃度（μg/L）

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文4 過(guò)表達(dá) Cyr61 以時(shí)間依賴性方式抑制 NRK-49F 細(xì)胞的增生能力。NRK-49F 細(xì)胞分為空白組、對(duì)照組（空載質(zhì)粒組）、Cyr61+組（過(guò)表達(dá) Cyr61質(zhì)粒組）。 PCR 分析顯示，與空白組及對(duì)照組比較，Cyr61+組細(xì)胞 Cyr61 mRNA顯著高表達(dá)（p<0.001，圖 4A），達(dá) 4000 倍左右，而空白組與對(duì)照組對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western 半定量分析亦顯示，Cyr61+組細(xì)胞 Cyr61 蛋白表達(dá)較空白組及對(duì)照組為高水平（p<0.01，圖 4B 和 4C），而空白組與對(duì)照組對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CCK8結(jié)果顯示，在相同轉(zhuǎn)染時(shí)間下，與空白組和對(duì)照組對(duì)比，Cyr61+組的增殖活性明顯受到抑制（均 p <0.01，圖 4D），而空白組及對(duì)照質(zhì)粒組的細(xì)胞增殖變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與 Cyr61+質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 24h 相比，轉(zhuǎn)染 48h 時(shí)細(xì)胞增生能力受到顯著抑制，轉(zhuǎn)染 72h 對(duì)細(xì)胞損傷更為嚴(yán)重，細(xì)胞活性大約僅為同時(shí)間段對(duì)照組的 25%（均 p<0.05，圖 4D）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們選用 48h 作為最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間點(diǎn)。A. B.

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