【摘要】：研究背景與目的前列腺癌是男性最高發(fā)腫瘤,隨著PSA篩查的普及,我國的前列腺癌新發(fā)人數(shù)逐年上升,且其造成的死亡人數(shù)僅次于肺癌,給老年男性的健康帶來了巨大威脅,給家庭和社會造成了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。前列腺癌具有親骨性,60%-80%因前列腺癌死亡的病人伴有骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生。由于頑固性骨痛骨、骨折、脊髓神經(jīng)壓迫、高鈣血癥和造血功能障礙等骨相關(guān)事件(skeletal-related events,SREs)的發(fā)生,前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的生活質(zhì)量較差且生存率較低。目前,針對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)癥狀治療的主要目的之一在于控制骨相關(guān)癥狀,提高患者生活質(zhì)量。為了達(dá)到此目的,臨床常用雙磷酸鹽、RANKL中和抗體等藥物抑制破骨細(xì)胞功能,但這些治療方式并不能有效提高患者的生存率。此外,放化療會帶來較大的副作用,降低患者的生存質(zhì)量。因此,尋找一種既能控制骨轉(zhuǎn)移癥狀,又能控制腫瘤進(jìn)展,同時具有較小毒副作用的藥物顯得尤為重要。但是,研發(fā)新藥需要較長的周期、人力和物力,且存在較大的臨床轉(zhuǎn)化障礙。與此相反的是,老藥新用的策略(藥物重定位)則可在較短的周期內(nèi),挖掘現(xiàn)有藥物的未知功效,并運(yùn)用到其余疾病的治療中,是研發(fā)抗癌藥物的一種快速高效的策略。鹽霉素是一種離子載體類抗生素,在畜牧行業(yè)中常用其防治病蟲害。近年來,有研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤活性,可特異性殺滅乳腺癌干細(xì)胞,并在前列腺癌、卵巢癌和肝癌等諸多腫瘤中發(fā)現(xiàn)了相似的抗癌作用。更多深入的研究發(fā)現(xiàn)了鹽霉素對腫瘤細(xì)胞氧化應(yīng)激、線粒體生物合成和自噬的發(fā)生等生物過程具有重要調(diào)節(jié)作用。但是面對鹽霉素引起的諸多現(xiàn)象及其相應(yīng)的機(jī)制,并無統(tǒng)一的、全面的機(jī)制能夠解釋其多樣化的藥物作用。藥物分子(作為配體)同大分子靶點(diǎn)的相互作用是藥物發(fā)揮作用的根本之一,小分子藥物發(fā)揮作用的模式包括最常見的靜電作用,如離子鍵、氫鍵和范德華力等;較為緊密的共價鍵結(jié)合以及疏水結(jié)合等。鹽霉素發(fā)揮藥效的具體機(jī)制尚屬未知。此外,對鹽霉素敏感的腫瘤類型中,乳腺癌和前列腺癌具有性激素依賴性和親骨性等共同點(diǎn),目前已知鹽霉素能夠抑制前列腺癌雄激素受體的表達(dá),但其對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移是否有治療作用尚無報(bào)道。因此,本課題的目的在于研究鹽霉素對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用及其發(fā)揮作用的生理和分子機(jī)制,通過藥物重定位的策略,探尋將鹽霉素作為前列腺癌骨相關(guān)事件乃至晚期前列腺癌的臨床治療新途徑。同時,本課題欲初步探索鹽霉素可能的結(jié)合靶點(diǎn),為將鹽霉素作為一種新型抗腫瘤藥物打下基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方法1、細(xì)胞實(shí)驗(yàn):利用CCK-8細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)測定鹽霉素對前列腺癌細(xì)胞系、成骨細(xì)胞前體細(xì)胞、破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的抑制作用,并計(jì)算半數(shù)效應(yīng)計(jì)量;利用細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、transwell小室遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)(覆蓋或不覆蓋matrigel膠)檢測鹽霉素對腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響;利用流式細(xì)胞儀和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測鹽霉素對腫瘤細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的影響;利用成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基與前列腺癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,并檢測鹽霉素對該過程的影響;利用m-CSF與Rank Ligand誘導(dǎo)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化,并檢測其對骨板的吸收能力,同時檢測鹽霉素對破骨分化和骨吸收的影響;使用質(zhì)粒、干擾RNA轉(zhuǎn)染和慢病毒感染等方式調(diào)控細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá);2、分子實(shí)驗(yàn):通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot,WB)、蛋白免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,co-IP)、實(shí)時定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR)、免疫組織化學(xué)染色(Immunohistochemistry,IHC)、免疫熒光(Immunofluorescence,IF)研究基因、蛋白質(zhì)的表達(dá)量變化情況、相互作用及蛋白質(zhì)細(xì)胞定位;蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)研究組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)以及其變化;分別使用堿性磷酸酶(ALP)染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色檢測成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞分化;使用茜素紅染色檢測成骨細(xì)胞鈣沉積;通過氨基-羧基脫水縮合反應(yīng)(DMAP催化條件下)制備磁珠-鹽霉素復(fù)合物;通過普魯士藍(lán)染色檢測組織中鐵離子含量;通過Liperfluo試劑檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物含量;3、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):采用慢病毒感染的方法構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶(luciferase)的前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞系,并采用在Nod-Scid小鼠左心室注射或脛骨原位注射的方式構(gòu)建前列腺癌骨轉(zhuǎn)移模型;采用小鼠腹腔注射的方式給藥;使用小鼠活體成像儀拍攝并記錄腫瘤熒光強(qiáng)度;使用4%多聚甲醛固定小鼠骨組織48小時后換用酒精固定,此后用EDTA脫鈣兩周;4、影像學(xué)檢測:MicroCT檢測小鼠脛骨CT值,檢測脛骨近端骨骺端骨小梁密度、數(shù)量、厚度、分離度等指標(biāo),并以計(jì)算機(jī)輔助進(jìn)行數(shù)據(jù)三維重建,構(gòu)建三維圖像和動態(tài)圖像;電鏡觀察鹽霉素對前列腺癌線粒體、溶酶體等細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的影響;5、化學(xué)信息學(xué)分析:為了探尋鹽霉素的潛在靶點(diǎn),我們使用了SwissTargetPrediction網(wǎng)站(http://www.swisstargetprediction.ch)的小分子靶點(diǎn)預(yù)測功能以及基于PDB數(shù)據(jù)庫的計(jì)算機(jī)模擬晶體匹配度篩選策略;采用計(jì)算機(jī)模擬分析對接的方法模擬鹽霉素-蛋白質(zhì)的結(jié)合模式;采用LeDock_GO軟件進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬藥物-蛋白結(jié)合(分子對接)實(shí)驗(yàn);6、高通量測序及公共數(shù)據(jù)提取:使用了mRNA轉(zhuǎn)錄組測序研究鹽霉素對前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的調(diào)控作用;使用了GCBI網(wǎng)站對公共數(shù)據(jù)庫的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,用于探索成骨細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞的相互作用;7、分子-蛋白質(zhì)親和力檢測:采用了表面等離子共振(SPR)技術(shù)檢測鹽霉素與靶蛋白的親和力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果第一部分:鹽霉素抑制前列腺癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移1、CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示鹽霉素可顯著抑制前列腺癌細(xì)胞增殖,但對正常前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-1)和前列腺增生上皮細(xì)胞(BPH-1)的作用較弱;2、鹽霉素致使前列腺癌細(xì)胞凋亡率升高;3、劃痕和遷移、侵襲小室實(shí)驗(yàn)表明,鹽霉素可顯著增大前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞系(C4-2B、PC-3)的劃痕面積、減少遷移至0.8μm尼龍膜下的細(xì)胞數(shù)量。4、小鼠左心室注射前列腺癌骨轉(zhuǎn)移C4-2B和PC-3細(xì)胞系,均成功構(gòu)建全身腫瘤轉(zhuǎn)移模型,鹽霉素治療組的腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量及骨轉(zhuǎn)移灶數(shù)量均少于對照組;5、通過小鼠脛骨平臺向骨髓腔注射前列腺癌細(xì)胞構(gòu)建前列腺癌脛骨荷瘤模型具有較高的成功率和穩(wěn)定性,鹽霉素治療組的腫瘤熒光強(qiáng)度明顯弱于對照組;6、骨MicroCT檢測顯示,C4-2B細(xì)胞系構(gòu)建的骨荷瘤模型主要呈成骨性生長,而PC-3細(xì)胞系構(gòu)建的骨荷瘤模型則表現(xiàn)為溶骨性;在C4-2B骨荷瘤模型中,鹽霉素治療組小鼠的脛骨骨小梁密度明顯高于對照組,但異位成骨卻受到明顯抑制,骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)略有上升,骨小梁分離度(Tb.Sp)略有下降;在PC-3骨荷瘤模型中,鹽霉素治療組小鼠的脛骨骨小梁密度明顯高于對照組,腫瘤介導(dǎo)的骨吸收明顯減弱,骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)顯著上升,骨小梁分離度(Tb.Sp)顯著下降;7、HE染色切片顯示鹽霉素治療組小鼠脛骨異位成骨和受腫瘤破壞程度均下降;IHC染色發(fā)現(xiàn)鹽霉素治療組腫瘤細(xì)胞Caspase-3凋亡相關(guān)蛋白染色加深。第二部分:鹽霉素抑制腫瘤-成骨-破骨惡性循環(huán)的發(fā)生1、鹽霉素處理C4-2B細(xì)胞系后mRNA測序顯示有6183個基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生1.5倍以上變化,其中1685個基因的變化水平超過4倍;凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的編碼基因CASP3上升1.73倍;增殖相關(guān)基因MKI67表達(dá)下調(diào)5.89倍;GO分析提示:受到鹽霉素處理的前列腺癌細(xì)胞,DNA復(fù)制受到明顯抑制;KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)鹽霉素致使腫瘤鐵死亡途徑被顯著激活;細(xì)胞因子-受體相互作用相關(guān)的通路也發(fā)生了明顯的改變;DNA復(fù)制和細(xì)胞周期相關(guān)通路被明顯抑制;2、鹽霉素將前列腺癌細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期;克隆形成實(shí)驗(yàn)中,鹽霉素處理組的前列腺癌細(xì)胞克隆數(shù)量明顯減少;鹽霉素致使前列腺癌細(xì)胞表面鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體CD71表達(dá)增多;鹽霉素導(dǎo)致CD71蛋白的mRNA下降;鐵死亡促進(jìn)劑可將鹽霉素對PC-3細(xì)胞的抑制作用提高20余倍;鹽霉素聯(lián)用鐵死亡促進(jìn)劑后,前列腺癌在小鼠脛骨中的生長明顯弱于單獨(dú)使用鹽霉素治療組;3、鹽霉素對成骨細(xì)胞不具有抑制增殖的功能;鹽霉素不能抑制成骨分化培養(yǎng)基對成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過程;鹽霉素抑制前列腺癌誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化;鹽霉素抑制前列腺癌細(xì)胞合成及釋放TGFb-1;鹽霉素治療組的小鼠荷瘤脛骨ALP染色強(qiáng)度明顯降低;4、鹽霉素抑制破骨細(xì)胞增殖及破骨分化和骨吸收功能;鹽霉素抑制單核巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程中Cathepsin K(Ctsk)、ATPase H~+transporting V0 subunit d2(Atp6v0d2)和Acid Phosphatase 5,Tartrate Resistant(Acp5)等基因的表達(dá),并具有濃度依賴性;鹽霉素治療組的小鼠荷瘤脛骨TRAP染色強(qiáng)度明顯降低。第三部分:鹽霉素發(fā)揮藥效的分子機(jī)制及驗(yàn)證1、采用化學(xué)信息學(xué)方法在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中篩選到15個鹽霉素潛在靶蛋白;用SEA法在PBD數(shù)據(jù)庫中篩選到5個鹽霉素靶蛋白;計(jì)算機(jī)模擬對接實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鹽霉素可與預(yù)測的5個靶蛋白結(jié)合,其中3個蛋白親和力較低,2個蛋白親和力較高;與鹽霉素親和力最高的靶點(diǎn)是14-3-3ζ/C-RAF蛋白復(fù)合體,鹽霉素的羧基與14-3-3ζ/C-RAF界面處的鉀離子相互作用,并與Lys120和與Ser45的氫鍵形成鹽橋。相鄰的乙基深入嵌合到14-3-3ζ蛋白Lys120和Phe117之間的疏水裂縫中,形成較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu);2、挑選了分子對接預(yù)測親和力最高的配體14-3-3ζ/C-RAF蛋白復(fù)合體進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,鹽霉素磁珠IP產(chǎn)物中,蛋白質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)存在14-3-3ζ蛋白;SPR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證鹽霉素與14-3-3ζ蛋白結(jié)合;3、IP結(jié)果顯示,鹽霉素處理前列腺癌細(xì)胞后,14-3-3ζ與C-RAF、YAP-1、β-Catenin蛋白的結(jié)合增多;免疫熒光顯示,鹽霉素處理后的前列腺癌細(xì)胞中,YAP-1和β-Catenin入核受到抑制,滯留在細(xì)胞質(zhì)中;4、敲除14-3-3ζ后,鹽霉素在低濃度下對前列腺癌細(xì)胞的抑制作用明顯減弱;敲除14-3-3ζ后,鹽霉素對小鼠體內(nèi)腫瘤生長的抑制作用下降。結(jié)論本課題采用藥物重定位的策略,發(fā)現(xiàn)了鹽霉素抗前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的功能。鹽霉素通過作用于前列腺癌細(xì)胞、破骨細(xì)胞以及前列腺癌與成骨細(xì)胞的相互作用,達(dá)到抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的功能。對于腫瘤細(xì)胞而言,鹽霉素可阻滯其周期、誘導(dǎo)其鐵死亡,從而抑制其轉(zhuǎn)移能力;對于破骨細(xì)胞而言,鹽霉素抑制其分化,阻礙其骨吸收;對于成骨細(xì)胞而言,鹽霉素不能抑制其增值或分化,但鹽霉素可阻斷腫瘤分泌TGF-β1,從而阻斷腫瘤介導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化和異位成骨。化學(xué)信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了鹽霉素潛在的結(jié)合靶點(diǎn),我們挑選并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了14-3-3ζ蛋白可作為鹽霉素發(fā)揮藥效的靶點(diǎn)之一。綜上所述,鹽霉素可增加14-3-3ζ蛋白與靶蛋白之間的結(jié)合能力,起到類似“雙面膠”或“腳手架”的作用,使復(fù)合物穩(wěn)定性提高,抑制C-RAF、YAP-1以及β-Catenin等腫瘤相關(guān)蛋白的功能,同時抑制鋅指蛋白36和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的mRNA結(jié)合,從而引起腫瘤表形改變,表現(xiàn)為周期受阻、轉(zhuǎn)移能力下降、分泌細(xì)胞因子(如TGF-β1)受阻和細(xì)胞攝取鐵增加等。此外,Hippo、Wnt通路在破骨細(xì)胞分化過程中扮演了重要角色,鹽霉素通過抑制YAP-1及β-Catenin入核發(fā)揮功能,抑制破骨細(xì)胞分化。其次,鹽霉素通過抑制前列腺癌細(xì)胞TGF-β1的分泌,阻斷了前列腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化和成骨過程。因此,鹽霉素同時對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移中涉及的腫瘤細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞這三個關(guān)鍵因素發(fā)揮了抑制作用,從而抑制了前列腺癌骨轉(zhuǎn)移。鹽霉素或可成為一種經(jīng)濟(jì)高效的抗前列腺癌骨轉(zhuǎn)移藥物。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.25
【圖文】：

軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鹽霉素通過增加 14-3-3ζ與其靶蛋白結(jié)合的穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)腫瘤相關(guān)通路的活化。同時，文獻(xiàn)報(bào)道 14-3-3 家族蛋白可與鋅6（ZFP36/TTP）發(fā)生結(jié)合，并抑制其降解 mRNA 的功能[27]，并且鋅指蛋的 mRNA 序列中包含鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體的 mRNA[28-34]。因此，我們推測鹽霉強(qiáng) 14-3-3ζ與鋅指蛋白 36 的結(jié)合，抑制后者對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 mRNA 的從而提高細(xì)胞膜表面鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度的并最終誘發(fā)鐵死亡，從而抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。

大學(xué)博士學(xué)位論文三、結(jié)果（一）鹽霉素抑制 C4-2B 及 PC-3 細(xì)胞遷移能力霉素可有效抑制前列腺癌細(xì)胞 C4-2B 和 PC-3 體外劃痕愈合，在 6理細(xì)胞 48 小時后，細(xì)胞劃痕愈合面積不超過 20%，但對照組愈合0%-90%。如圖 1-1 所示。

鹽霉素可有效抑制前列腺癌細(xì)胞 C4-2B 和 PC-3 體外劃痕愈合，在 600處理細(xì)胞 48 小時后，細(xì)胞劃痕愈合面積不超過 20%，但對照組愈合程 70%-90%。如圖 1-1 所示。（二）鹽霉素抑制 C4-2B 及 PC-3 細(xì)胞侵襲能力鹽霉素處理細(xì)胞 48 小時后，可有效抑制前列腺癌細(xì)胞 C4-2B 和 PC-3 圖 1-1 鹽霉素抑制 C4-2B 和 PC-3 劃痕愈合

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5 馬馳;聯(lián)合應(yīng)用甲萘醌、維生素C和鹽霉素治療膠質(zhì)瘤的體外研究[D];吉林大學(xué);2014年

6 趙世君;鹽霉素誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和抗血管生成抑制人腦膠質(zhì)瘤生長機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2017年

7 張弓;鹽霉素抑制鼻咽癌干細(xì)胞的作用及機(jī)理研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

8 蔡啟亮;CD44+腫瘤干/祖細(xì)胞在前列腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

9 孫警輝;力、化學(xué)刺激對肝癌干細(xì)胞遷移、分化行為的影響及其相關(guān)分子機(jī)理[D];重慶大學(xué);2016年

10 王晶宇;鹽霉素抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究[D];蘭州大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張曉潔;鹽霉素高產(chǎn)機(jī)制解析及菌株改造[D];上海交通大學(xué);2017年

2 張翅騰;鹽霉素通過下調(diào)PGE2的表達(dá)促進(jìn)DU145細(xì)胞凋亡和抑制微球體成[D];南華大學(xué);2018年

3 江孝蓉;細(xì)胞自噬通過ATG3/AKT/mTOR信號途徑抵抗鹽霉素抗腫瘤作用的分子機(jī)制[D];南華大學(xué);2018年

4 趙旭;鹽霉素對腎上腺皮質(zhì)癌SW13細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制探討[D];南方醫(yī)科大學(xué);2017年

5 張亞飛;鹽霉素高產(chǎn)菌的高通量篩選及油控制發(fā)酵工藝[D];華東理工大學(xué);2017年

6 劉朋;鹽霉素菌種選育和補(bǔ)油發(fā)酵工藝的優(yōu)化[D];華東理工大學(xué);2011年

7 方宇鵬;鹽霉素誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞自噬的體外研究[D];南華大學(xué);2017年

8 周明澍;鹽霉素聯(lián)合三氧化二砷殺傷腎癌KCC853細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];南華大學(xué);2017年

9 楊侃侃;鹽霉素上調(diào)ATP2A3誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的體外研究[D];南華大學(xué);2017年

10 Muhammed Humayoon Samo;苜蓿和羊草中添加鹽霉素對瘤胃體外發(fā)酵的影響[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

本文編號：2782396