發(fā)布時(shí)間：2020-08-06 12:09

【摘要】：研究背景:膀胱癌(Bladder Cancer,BCa)是最常見的泌尿系腫瘤,并伴隨極差的預(yù)后。手術(shù)治療外,基于鉑類藥物的化療仍然是目前治療膀胱癌的主要方法。腫瘤干細(xì)胞(CSCs)與腫瘤的發(fā)生,復(fù)發(fā),轉(zhuǎn)移和耐藥性有關(guān)。以DNA甲基化為代表的表觀遺傳學(xué)調(diào)控對(duì)于腫瘤干細(xì)胞的干性維持具有重要意義,DNA甲基化的生成需要甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的參與,用DNA甲基化抑制劑地西他濱(Decitabine,DAC)進(jìn)行低劑量治療已被證明適用于某些類型癌癥的治療。因此低劑量DAC在包括膀胱癌在內(nèi)的實(shí)體瘤治療中具有值得期待的前景。然而,其抗腫瘤作用和機(jī)制依賴于環(huán)境,其活性從未在膀胱癌治療中進(jìn)行過系統(tǒng)研究。本研究通過體內(nèi)和體外研究探索低劑量地西他濱與化療藥物聯(lián)用對(duì)于膀胱癌尤其是膀胱癌干細(xì)胞的療效和機(jī)制,為臨床用藥提供新線索。研究目的:本研究使用BBN誘導(dǎo)的BCa小鼠模型,在體內(nèi)和體外水平明確低劑量地西他濱與化療藥物聯(lián)用對(duì)于膀胱癌的治療效應(yīng)和分子機(jī)制。采用最新的生命醫(yī)學(xué)研究手段,系統(tǒng)地研究臨床常用化療藥物的細(xì)胞殺傷和耐藥形成機(jī)制,發(fā)展有效的多種不同類型藥物聯(lián)用方案,精準(zhǔn)地指導(dǎo)臨床化療用藥。研究方法:首先,本課題組使用先前建立的與人類疾病具有高度分子相似性的BBN(N-butyl-N-4-hydroxybutyl Nitrosamine)誘導(dǎo)的Krt14~(CreER);Rosa~(EGFP)和Sox2~(CreERT2);R26~(tdTomato)小鼠生成膀胱癌模型,對(duì)其使用了甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑DAC和兩種化療藥,吉西他濱和順鉑進(jìn)行治療。在BBN誘導(dǎo)了26周后,我們分別用了這三種藥物進(jìn)行單獨(dú)治療,或分別使用DAC與另外兩種化療藥聯(lián)合治療的方案,30周后處死小鼠。以評(píng)估不同藥物組合對(duì)膀胱癌的治療效果。另外,我們用他莫昔芬誘導(dǎo)K14creGFP小鼠表達(dá)GFP,誘導(dǎo)Sox2creTomato小鼠表達(dá)Tomato,進(jìn)行譜系追蹤實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步分析不同藥物組合對(duì)膀胱癌干細(xì)胞的影響。在體外實(shí)驗(yàn)中,我們用100nM的DAC處理膀胱癌細(xì)胞系,進(jìn)行以下表型檢測(cè):凋亡、對(duì)于順鉑和吉西他濱的敏感性(IC_(50))、腫瘤干細(xì)胞比例及腫瘤干細(xì)胞成球數(shù)量,確認(rèn)低劑量DAC處理在體外對(duì)于膀胱癌細(xì)胞的殺傷效果;我們進(jìn)行甲基化DNA免疫沉淀(MEDIP)測(cè)序以及mRNA-seq篩選參與DAC在BCa細(xì)胞中的藥物作用的靶基因和信號(hào)通路,Bisulfite-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR確認(rèn)DAC處理對(duì)于該靶基因的影響。最后通過人源異種移植物(PDX)模型評(píng)估不同藥物組合的臨床相關(guān)性。研究結(jié)果:在這項(xiàng)研究中,我們證明了對(duì)于BBN誘導(dǎo)的小鼠模型和膀胱癌細(xì)胞系,低劑量DAC聯(lián)合順鉑或吉西他濱治療顯示出比單藥處理更好的抗腫瘤效果。重要的是,我們發(fā)現(xiàn)低劑量DAC和順鉑或吉西他濱的組合可以抑制CSCs在體內(nèi)的自我更新能力,并在體外降低了ALDH+和CD44V6+干細(xì)胞的比例及其成球能力,抑制CSCs對(duì)順鉑和吉西他濱的化學(xué)抗性。甲基化DNA免疫沉淀(MEDIP)測(cè)序及表達(dá)組測(cè)序綜合分析篩選出了參與DAC在BCa細(xì)胞中的藥物作用的靶基因SOCS3,及其參與的信號(hào)通路STAT3信號(hào)通路,低劑量DAC可以使SOCS3的DNA去甲基化和再激活。低劑量地西他賓聯(lián)合化療在源自人患者樣品的異種移植瘤中同樣顯示出較好的療效,進(jìn)一步驗(yàn)證了以上研究結(jié)果的臨床相關(guān)性。研究結(jié)論:本研究首次在體內(nèi)和體外發(fā)現(xiàn)低劑量DAC治療通過抑制BCa干細(xì)胞的干性來提高順鉑和吉西他濱治療BCa的功效,通過抑制STAT3信號(hào)通路抑制BCa中CSCs的自我更新能力。我們的研究結(jié)果揭示了一種潛在促進(jìn)BCa化療臨床療效的全新治療方法。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.14
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)策略示意圖：BBN 誘導(dǎo) Krt14CreER; Rosa26EGFP 小鼠 26 周后進(jìn)行莫昔芬連續(xù)注射 3 天后處死。3.1.1 Schematic diagrams show the experimental strategies. Chemotherapeuticsrated to Krt14CreER; Rosa26EGFP mice after 26 weeks of BBN treatment andwas injected for 3 consecutive days before sacrifice.表 5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組和藥物處理方式Table 5Animal experiment grouping and drug treatment對(duì) 照組順鉑 吉 西 他濱地西他濱 順鉑+地西他濱 吉西他濱濱導(dǎo)PBS注射Cis 注射次Gem 注射 次DAC 注射連續(xù) 5天DAC 注射連續(xù) 5天+ Cis 注射次DAC 注射天+ Gem次導(dǎo)PBS注射Cis 注射次Gem 注射 次DAC 注射連續(xù) 3天DAC 注射連續(xù) 3天+ Cis 注射次DAC 注射天+ Gem次導(dǎo)PBS注射Cis 注射次Gem 注射 次DAC 注射連續(xù) 5天DAC 注射連續(xù) 5天+ Cis 注射次DAC 注射天+ Gem次導(dǎo)PBSDAC 注DAC 注射連續(xù) 3DAC 注射

.2 通過組織病理學(xué)確定不同治療組的侵潤(rùn)性 BCa of invasive BCa development as determined by histotreatment groups.膀胱重量/體重經(jīng)單因素方差分析，然后 Bonferro p <0.05，**p <0.01；相對(duì)于順鉑/吉西他濱治療組<0.01）lculated as (gross bladder weight/body weight) 100%eatment, #p < 0.05, ##p < 0.01 relative to cisplatin/gne wayANOVAfollowed by Bonferroni Multiple Co劑量 DAC 在體內(nèi) BCa 治療中的效果，我們

膀胱重量/體重經(jīng)單因素方差分析，然后 Bonferro p <0.05，**p <0.01；相對(duì)于順鉑/吉西他濱治療組<0.01）lculated as (gross bladder weight/body weight) 100%eatment, #p < 0.05, ##p < 0.01 relative to cisplatin/gene wayANOVAfollowed by Bonferroni Multiple Co劑量 DAC 在體內(nèi) BCa 治療中的效果，我們度分子相似性的 BBN 誘導(dǎo)膀胱癌的小鼠模病診斷治療指南》（人民衛(wèi)生出版社，2011括順鉑和吉西他濱等，因此本研究中運(yùn)用了2 只 Krt14CreER; RosaEGFP雄性小鼠被隨機(jī)分成加入 BBN ，誘導(dǎo) 26 周生成腫瘤后。分別tabine 的單藥或組合用藥進(jìn)行治療（Fig 3.1.生率（Fig 3.1.2），發(fā)現(xiàn)模擬治療組（空白侵潤(rùn)性 BCa，而在順鉑，吉西他濱和 DAC 單

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