【摘要】：急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)是臨床常見致死性的綜合征,但是AKI的發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜,目前缺乏有效干預(yù)手段。腎臟缺血再灌注損傷(Ischemia Reperfusion Injury,IRI)是常見的AKI病因。IRI可引起腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生損傷,甚至死亡,導(dǎo)致腎功能急劇下降。既往研究表明,親環(huán)素D(Cyclophilin D,CypD)開放細(xì)胞線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變孔(mitochondrial membrane permeability transition pore,MPTP)可引起細(xì)胞損傷進(jìn)而介導(dǎo)腎臟IRI;但是其中引起CypD開放MPTP的機(jī)制尚未闡明。同期研究也發(fā)現(xiàn)在心肌、神經(jīng)元等細(xì)胞中p53可與CypD相互結(jié)合從而開放MPTP。目的:本研究通過體內(nèi)實(shí)驗,觀察大鼠腎臟IRI中p53及CypD的變化對腎小管上皮細(xì)胞損傷的作用;進(jìn)一步運(yùn)用體外細(xì)胞模型,探討p53-CypD在腎臟IRI中的作用機(jī)制。方法:1.體內(nèi)實(shí)驗:SD大鼠雙側(cè)腎臟缺血35分鐘,再灌注24小時建立IRI動物模型,檢測血清肌酐及尿素氮水平、PAS染色觀察腎臟病理改變、Western blot及TUNEL染色檢測腎小管上皮細(xì)胞凋亡、透射電鏡觀察腎小管上皮細(xì)胞線粒體形態(tài)學(xué)改變、Western blot及免疫熒光染色觀察腎小管中CypD及p53的改變。2.體外實(shí)驗:在體外ATP耗竭細(xì)胞模型中,使用環(huán)孢素A(CsA)抑制親環(huán)素D功能或siRNA下調(diào)p53的表達(dá);通過Western blot及Annexin V-FITC/PI染色檢測不同處理下細(xì)胞的凋亡情況、JC-1染色檢測不同處理下細(xì)胞線粒體膜電位轉(zhuǎn)換(mitochondrial permeability transition,MPT)、免疫熒光染色及免疫共沉淀觀察CypD與p53的相互作用。結(jié)果:1.體內(nèi)實(shí)驗:a)與對照組及假手術(shù)組比較,IRI組大鼠血清肌酐及尿素氮顯著升高,其腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性、脫落、腫脹,并主要在皮質(zhì)及外髓外部出現(xiàn)廣泛管型及小管堵塞;b)與對照組及假手術(shù)組比較,IRI組大鼠腎臟cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)、腎小管上皮細(xì)胞凋亡率(TUNEL染色陽性比例)顯著增加;c)與對照組及假手術(shù)組比較,IRI組大鼠腎小管上皮細(xì)胞線粒體出現(xiàn)明顯的腫脹或變形、雙層膜結(jié)構(gòu)喪失、線粒體嵴斷裂或消失;d)與對照組及假手術(shù)組比較,IRI組大鼠腎臟CypD表達(dá)無明顯改變,p53顯著上調(diào)并與CypD共定位。2.體外實(shí)驗:a)與對照組比較,ATP耗竭的HK-2細(xì)胞凋亡率(Annexin V陽性細(xì)胞比例)增加、cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)、發(fā)生MPT的細(xì)胞比例增加、p53表達(dá)增加,但是CypD表達(dá)無改變;b)與ATP耗竭組及溶劑對照組比較,CsA預(yù)處理的HK-2細(xì)胞經(jīng)受ATP耗竭時,細(xì)胞凋亡率減少、cleaved-caspase3的表達(dá)水平顯著下調(diào)、發(fā)生MPT的細(xì)胞比例減少、p53及CypD表達(dá)均無改變;c)與ATP耗竭組及siRNA對照組比較,si-p53預(yù)處理的HK-2細(xì)胞經(jīng)受ATP耗竭時,細(xì)胞凋亡率減少、cleaved-caspase3的表達(dá)水平顯著下調(diào)、發(fā)生MPT的細(xì)胞比例減少、CypD表達(dá)無改變;d)與對照組比較,ATP耗竭促進(jìn)HK-2細(xì)胞p53與CypD形成復(fù)合物。結(jié)論:在腎臟IRI中,p53及CypD能夠調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換及凋亡,且這種調(diào)控可能是通過形成復(fù)合物實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R692
【圖文】：

華南理工大學(xué)碩士學(xué)位論文18圖3-1 缺血再灌注導(dǎo)致大鼠腎功能受損。(A: 各組大鼠Scr水平；*與對照組比較P <0.05。(B: 各組大鼠 BUN 水平；*與假手術(shù)組比較 P <0.05。(C: 各組大鼠腎臟 PAS 染色；標(biāo)尺=100μm；黑色箭頭指示腎小管損傷。(D: 各組大鼠腎小管損傷評分; *P 與假手術(shù)組比較 P <0.05。con：對照組；sham：假手術(shù)組；IRI：缺血再灌注組；Scr：血肌酐；BUN：血尿素氮。Figure. 3-1 ischemia-reperfusion induces rats renal function damage.

3-2缺血再灌注誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。(A 各組大鼠腎臟cleaved-casp達(dá)水平的 Western blot 結(jié)果。(B 各組大鼠腎臟 cleaved-caspase3 表達(dá)水平 Western果的灰度分析；*與假手術(shù)組比較 P <0.05。(C 各組大鼠腎臟 TUNEL 染色陽性細(xì)例；*與假手術(shù)組比較 P <0.05。(D 各組大鼠腎臟 TUNEL 染色圖。con：對照組；sh手術(shù)組；IRI：缺血再灌注組；C- caspase3：cleaved-caspase3。ure3-2 Apoptosis was induced in renal proximal tubular epithelial cell of rats with IRI.小結(jié)本研究選取 7-9 周齡的雄性 SD 大鼠（200-250g），建立了雙側(cè)腎臟缺血 35 分鐘灌注 24 小時的腎臟損傷模型。結(jié)果提示：大鼠腎臟缺血再灌注模型可以導(dǎo)致大鼠急性腎損傷，并誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。大鼠血清生化指結(jié)果提示，與正常對照組及假手術(shù)組相比，腎臟缺血再灌注的大鼠血清中肌酐及在 24 小時內(nèi)發(fā)生了顯著增高，提示大鼠發(fā)生急性腎損傷；腎臟組織 PAS 染色圖可

2.11 統(tǒng)計學(xué)方法所有實(shí)驗過程均重復(fù)至少三次，結(jié)果用算數(shù)平均數(shù)±校準(zhǔn)差（mean±SEM）表示。數(shù)據(jù)資料利用 SPSS version 22.0 統(tǒng)計軟件包(IBM Co., USA)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組樣本間比較運(yùn)用 Student’s t 檢驗。多組樣本間比較運(yùn)用單因素方差分析(one-way ANOVA)和最小顯著性差異法(Least—SignificantDifference, LSD)。雙尾檢驗，p 值小于 0.05 認(rèn)為統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異。3.結(jié)果3.1 腎臟缺血再灌注對腎小管上皮細(xì)胞線粒體形態(tài)的影響利用透射電鏡觀察大鼠腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的顯微結(jié)構(gòu)，可以發(fā)現(xiàn)，正常組和假手術(shù)組大鼠腎臟小管上皮細(xì)胞線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)完整、線粒體嵴清晰可見，而在腎臟缺血再灌注大鼠的腎小管上皮細(xì)胞中，線粒體腫脹或變形、雙層膜結(jié)構(gòu)喪失、線粒體嵴斷裂或消失，提示腎臟缺血再灌注會導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生線粒體損傷。

【相似文獻(xiàn)】

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1 楊歡;p53-CypD在缺血再灌注介導(dǎo)的急性腎損傷中的機(jī)制研究[D];華南理工大學(xué);2019年

本文編號：2778296