發(fā)布時間：2020-08-01 20:40

【摘要】：數(shù)據(jù)先驗的理念正在改變各行各業(yè)的行為模式,其中以臨床大數(shù)據(jù)為支撐的人工智能醫(yī)療在臨床影像學、臨床病理學等診斷疾病上展示出了超高的診斷效力。值得一提的是,生物組學大數(shù)據(jù)在個性化分析復雜性疾病中展示出獨特的優(yōu)勢,有利于研究者深入全面了解疾病的概貌,發(fā)現(xiàn)個性化信息,為基礎實驗研究和臨床治療策略提供更加精細的指導,這也進一步鞏固了組學技術近年來在精準醫(yī)療領域不可撼動的地位。然而遺憾的是,大數(shù)據(jù)先驗模式在實驗生物學領域推廣卻較為緩慢。國際大型生物組學大數(shù)據(jù)計劃已經(jīng)積累了海量數(shù)據(jù),組學檢測成本的降低使得生物學數(shù)據(jù)呈指數(shù)增長,利用好組學大數(shù)據(jù),不僅能夠為實驗生物學節(jié)約研究成本,而且能夠研究者提供更加多維全面的信息,達到縮短研究周期,推動基礎實驗更加高效地發(fā)現(xiàn)問題和解決問題。膀胱癌是嚴重威脅人類健康的一種惡性腫瘤類型,但目前對膀胱癌分子機制的研究依然不清,導致臨床預防、監(jiān)測和治療捉襟見肘。組學大數(shù)據(jù)讓人們認識到非編碼RNA在控制基因表達,轉錄、轉錄后修飾和信號轉導等諸多方面的重要性,大量非編碼RNA已被鑒定為主要腫瘤類型中的致癌驅動因子和腫瘤抑制因子。遺憾的是,目前缺乏針對膀胱癌轉錄組學大數(shù)據(jù)多水平個性化高精度地分析。本論文利用大數(shù)據(jù)先驗和實驗學后驗的模式對膀胱癌兩種小分子事件進行研究。在大數(shù)據(jù)先驗部分構建了研究較為成熟的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和目前研究相對空白的核仁小分子RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)表達全景圖,同時也首次構建了膀胱癌mRNA以及本課題組感興趣的卡哈爾體(Cajal body,CB)相關核小分子RNA(Cajal body small nucleolar RNA,scaRNA)的相關轉錄因子全景圖及可變剪切表達全景圖,在此過程中提供了若干計算分析框架。在實驗后驗部分通過對多細胞系水平及臨床腫瘤組織水平RT-qPCR驗證,CRISPR-Cas9敲低實驗,mRNA高通量測序,原位雜交,裸鼠成瘤及RNA純化染色質(zhì)分離技術(ChIRP)等實驗手段,對數(shù)據(jù)先驗的結果進行了生物學意義的驗證。第一部分工作獲取了TCGA數(shù)據(jù)庫中膀胱癌最新注釋共13,918個lncRNA的測序表達數(shù)據(jù),構建了膀胱癌中差異lncRNA表達(differentially expressed lncRNAs,DELs)譜,通過系統(tǒng)地整合預后信息,更新并構建了膀胱癌DELs預后預測模型。新預后模型在預測腫瘤患者預后、腫瘤大小、淋巴結浸潤和病理分期上較單一指標效果提升顯著,值得一提的是,該指數(shù)可成為膀胱癌預后獨立的影響因素。最后,本部分在細胞系和組織樣本水平對計算獲取的DELs穩(wěn)固性進行了部分驗證。這部分工作提供了膀胱癌中DELs更為全面的解讀,為lncRNA實驗研究提供了詳盡的參閱信息。第二部分工作利用膀胱癌組織1,232個小RNA-seq水平的數(shù)據(jù),全面精確繪制了膀胱癌中研究空白的snoRNA表達譜。結果顯示,這類目前在膀胱癌中尚未引起研究者足夠重視的小分子在腫瘤組織和正常組織中的表達存在明顯差異,并且數(shù)目多達230個,部分snoRNA對預判膀胱癌具有較高價值,提示部分snoRNA可能對膀胱癌的生物學行為具有重要貢獻。根據(jù)數(shù)據(jù)先驗的結果,我們對部分snoRNA的計算可靠性結果進行細胞和組織水平qPCR驗證,為膀胱癌snoRNA研究提供了參選點依據(jù)。根據(jù)數(shù)據(jù)先驗的提示,選取了與本課題組前期研究Cajal body相關,并且在膀胱癌中顯著高表達以及具有較高疾病預判能力的SCARNA12進行深入研究。本部分利用real time RT-qPCR在臨床膀胱癌組織和多細胞系水平驗證了SCARNA12的表達水平,采用原位雜交進一步確定了SCARNA12在組織層面的分布特征。通過“表達相關基因最有可能是互相調(diào)控和影響”的理論,本課題首次構建了以SCARNA12為代表的SCARNA小分子功能分析框架,基因富集分析算法解析了SCARNA12在膀胱癌中發(fā)揮作用的主要潛在方式。第三部分工作中,本課題首次利用CRISPR-Cas9基因編輯技構建T24細胞系SCARNA12敲低模型進行功能探索。SCARNA12敲低后,顯著抑制了膀胱癌細胞生長,癌細胞停滯在G0/G1期,不能完全進入細胞周期S期,從而導致了細胞增殖速度減慢。SCARNA12對膀胱癌細胞的生長抑制也可能通過誘導凋亡而實現(xiàn),SCARNA12敲低后,晚期凋亡顯著增加。此外,我們還發(fā)現(xiàn)敲低后的T24細胞侵襲能力降低。裸鼠成瘤實驗瘤體有縮小的趨勢。目前,世界上尚無關于SCARNA在膀胱癌的研究方案可參考,膀胱癌中也無類似指標的研究可推測SCARNA發(fā)揮生物學功能的方式,我們首次通過實驗驗證了數(shù)據(jù)先驗的穩(wěn)固性,并全面展示了SCARNA12體內(nèi)外水平的功能。第四部分工作嘗試對SCARNA12的分子機制進行解讀。我們首次利用RNA-seq技術在全基因組轉錄水平檢測SCARNA12敲低前后轉錄組的變化。SCARNA12敲低顯著影響了多達1,155個基因的表達量,并且與細胞外基質(zhì)相關的通路富集頻率最高,與大數(shù)據(jù)分析結果吻合,這是首次以高通量測序數(shù)據(jù)在mRNA層面闡明SCARNA12發(fā)揮功能的方式。然后,我們成功的首次使用RNA純化染色質(zhì)分離技術(ChIRP)獲取了SCARNA12互作結合調(diào)控的蛋白,發(fā)現(xiàn)組蛋白家族成員H2AFZ(H2A histone family member Z,H2AFZ)與MYCN(MYCN proto-oncogene,BHLH transcription factor)等蛋白與SCARNA12存在物理空間位置的結合。特別意思的是,本課題首次結合轉錄因子算法(Binding Analysis for Regulation of Transcription,BART)發(fā)現(xiàn)H2AFZ與MYCN均非常可能是SCARNA12敲低以后的差異基因的上游調(diào)控的因子。在首次整合現(xiàn)所有公開針對組蛋白相關基因H2AFZ與轉錄因子MYCN ChIP-seq大數(shù)據(jù)分析時發(fā)現(xiàn),H2AFZ潛在靶基因為E3泛素蛋白連接酶(deltex E3 ubiquitin ligase 3,DTX3),MYCN潛在靶基因為連接粘附分子2(junctional adhesion molecule 2,JAM2)和核因子IX(nuclear factor I X,NFIX)。這為以SCARNA12為代表的snoRNA在基因層面轉錄調(diào)控深入分析提供了參考標準。第五部分工作首次展示了膀胱癌細胞水平SCARNA12敲低后可變剪切事件譜以及膀胱癌大數(shù)據(jù)組織水平可變剪切的全貌。可變剪切事件分析是較mRNA水平更加精確的分析,在敲低SCARNA12后共發(fā)生了多達156個顯著的可變剪接事件,并且出現(xiàn)了6個未見任何報道的新的剪接體。結合臨床膀胱癌組織水平數(shù)據(jù),整合膀胱癌預后信息,我們發(fā)現(xiàn)了在9,731個基因中共檢測到高達39,508個mRNA剪接事件,提示膀胱癌組織中可變剪切事件的發(fā)生并非偶然事件。其中基因細絲蛋白A(filamin A,FLNA)在組織和細胞水平均發(fā)生了外顯子跳躍的可變剪接事件,并且具有預后評估的價值。這部分工作為后續(xù)膀胱癌以及SCARNA12可變剪切研究策略的制定提供了有力的證據(jù)支持。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.14
【圖文】：

12圖 1 生物醫(yī)學大數(shù)據(jù)現(xiàn)狀示意圖Figure 1 Schematic model of biomedical “BIG DATA”The BIG DATAconsists of ‘Omics & Systems Biology’, ‘Drugs & Other Chemicals’, ‘Biomedical Literature’, ‘Clinical Data’, ‘Biomedical Imaging’and etc.https://www.slideshare.net/mmayer/big-data-big-opportunity-47367009

大數(shù)據(jù)先驗模式構建膀胱癌非編碼 RNA 全景圖譜及 SCARNA12 的分子機制研究 2019 屆博士學位論文膀胱癌（bladdercancer,BLCA）是男性中第四大常見癌癥，也是女性中第 11 位最常見的癌癥，全球每年有超過 430,000 例癌癥[12]。根據(jù) 2019 年美國最新的膀胱癌流行病學數(shù)據(jù)，2019 年預計新發(fā)病例約為 80,470 例，其中男性 61,700 例，女性 18,770 例，預計死亡總數(shù) 17,670 名，包括 12,870 名男性和 4,800 名女性[13]（圖 2）。在中國，膀胱癌是 2015 年最常見的第 13種癌癥，總數(shù)為 80,500 例[14]。然而，膀胱癌的分子機制仍然很不清楚，導致膀胱癌篩查，監(jiān)測或預后分層的特定生物標志物的缺乏[15-19]。因此，迫切需要對膀胱癌的發(fā)生發(fā)展分子機制進行深入研究。

圖 3 非編碼 RNA 分類Figure 3 Classification of non-coding RNAsThe human genome consists of approximately 2% protein-coding sequences, which can bemessenger RNAs (mRNAs) and then translated into proteins. The majority of the human gnonprotein-coding DNA, which can be transcribed in (functional) noncoding RNAs (ncRNto their size and function, ncRNAs can be grouped into long noncoding RNAs (lncRNAncRNAs. The group of small ncRNAs, which are less than 200 nucleotides (nt) in lengthmicroRNAs (miRNAs), piwi-interacting RNAs (piRNAs), ribosomal RNAs (rRNAs), smspecific RNAs (scaRNAs), small-interfering RNAs (siRNAs), small nuclear RNAs (snRnucleolar RNAs (snoRNAs), and transfer RNAs (tRNAs). Beside their biogenesis from hamolecules, miRNAs can also be derived from lncRNAs and snoRNAs (highlighted in目前，某些 lncRNA 在膀胱癌中的臨床意義及機制得到了報于大數(shù)據(jù)針對lncRNA預后模型的建立及驗證未見報道。對于小分miRNA 在膀胱癌中的作用研究較多，部分研究針對測序數(shù)據(jù)和

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