【摘要】：目的:膀胱腫瘤是世界范圍內(nèi)最常見的腫瘤之一,高達70%的膀胱腫瘤患者最初診斷為非浸潤性膀胱腫瘤,其中超過70%的患者可能在未來復發(fā),甚至復發(fā)多次。雖然,目前膀胱腫瘤患者的術(shù)后5年生存率較高,但是其復發(fā)率極高,加重了患者精神以及經(jīng)濟負擔。因此,急需找到膀胱腫瘤復發(fā)以及預后不良的原因。腫瘤干細胞(CSCs)已被證明是多種癌癥進展和預后不良的一個重要因素。其作用機制及生物學功能的研究,近來越來越多地被發(fā)掘和研究。在膀胱腫瘤中,腫瘤干細胞的相關(guān)研究近年來越來越多,但完整的從腫瘤干細胞篩選到轉(zhuǎn)錄組分析,差異關(guān)鍵因子的篩選以及自上而下的深入調(diào)控通路在膀胱腫瘤研究中罕有詳細的報道。因此,在本研究中,我們通過篩選培養(yǎng)并鑒定了膀胱腫瘤干細胞(BCSCs),隨后通過轉(zhuǎn)錄組芯片分析發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細胞與其親代膀胱腫瘤細胞之間關(guān)鍵的差異表達基因(DEGs)。以此作為研究基礎(chǔ),篩選出了關(guān)鍵的差異因子,通過探索關(guān)鍵因子在膀胱腫瘤中的生物學特性,以及其主要影響的蛋白信號通路,探索其在膀胱腫瘤中的發(fā)揮作用的詳細生物學機制,為提示膀胱腫瘤進展和預后不良提供更加充分的理論基礎(chǔ)。研究方法:1.膀胱腫瘤干細胞的構(gòu)建,培養(yǎng)及鑒定選取2株穩(wěn)定膀胱腫瘤細胞系作為親代細胞系,通過無血清培養(yǎng)基篩選法構(gòu)建并培養(yǎng)其對應(yīng)的膀胱腫瘤干細胞。為了驗證腫瘤干細胞是否培養(yǎng)有效,待腫瘤干細胞成球穩(wěn)定,即傳代至第三代時,提取總RNA,利用PCR技術(shù)檢測腫瘤干細胞經(jīng)典蛋白的mRNA表達水平。通過動物實驗驗證腫瘤干細胞成瘤能力與其對應(yīng)親代細胞系成瘤能力的差異。2.差異基因的篩選通過使用Affymetrix HTA 2.0 Array進行腫瘤干細胞及其對應(yīng)親代細胞系的轉(zhuǎn)錄組分析。通過GCBI網(wǎng)絡(luò)分析實驗室平臺(http://www.gcbi.com.cn)進行分組和差異基因分析。將2株不同來源的腫瘤干細胞及其親代細胞系的差異基因進行交集處理,篩選出不同細胞系來源的共同差異基因作為候選差異基因。3.差異表達基因與膀胱腫瘤的預后相關(guān)性分析通過TCGA(GEPIA分析平臺)、ONCOMINE等網(wǎng)上公共數(shù)據(jù)庫,查詢候選差異基因在膀胱腫瘤以及正常膀胱組織中表達情況,以及對膀胱腫瘤生存率的影響。選取其中表達差異最明顯,且對膀胱腫瘤生存率具有較大影響的因子作為研究對象。從標本庫中隨機抽取病理診斷明確的膀胱腫瘤病例,提取癌組織和正常組織的總RNA和總蛋白,分別利用PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測上述篩選出的因子的表達情況。培養(yǎng)多種膀胱腫瘤細胞系,分別提取總RNA和總蛋白,分別利用PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測上述篩選出的因子的表達情況。4.關(guān)鍵因子在膀胱腫瘤細胞系中的功能實驗使用小RNA干擾技術(shù)以及小分子抑制劑的添加,處理膀胱腫瘤細胞系,利用CCK-8增殖實驗,EdU增殖能力檢測,克隆形成實驗,細胞周期檢測,細胞成球?qū)嶒炓约皩崟r細胞增殖能力檢測儀器等檢測手段進行細胞增殖能力的檢測。利用流式細胞儀技術(shù),通過檢測使用小RNA干擾技術(shù)以及小分子抑制劑的添加處理的細胞的FITC標記的Annexin V和Propidium Iodide,統(tǒng)計凋亡細胞比例,判斷干預因素對腫瘤細胞凋亡能力的影響。利用Transwell小室,通過檢測使用小RNA干擾技術(shù)以及小分子抑制劑的添加處理的細胞,進行細胞遷移侵襲能力的檢測。5.關(guān)鍵因子干預后,膀胱腫瘤細胞系的轉(zhuǎn)錄組,脂代謝組改變使用小分子抑制劑處理膀胱腫瘤細胞系,將此實驗組和對照組進行轉(zhuǎn)錄組學和脂代謝組學測序檢測。分析轉(zhuǎn)錄組差異蛋白通路以及差異脂肪酸。進行裸鼠皮下成瘤實驗,在4-6周Balb/c裸鼠皮下,注射膀胱腫瘤細胞,待形成50mm~3左右的瘤體時,使用小分子抑制劑和差異脂肪酸進行灌胃處理,1天2次,觀察移植瘤模型的生長情況喂養(yǎng)3周后,處死。觀察不同組別腫瘤大小重量。結(jié)果:1.通過選取2株穩(wěn)定膀胱腫瘤細胞系作為親代細胞系,通過無血清培養(yǎng)基篩選法成功構(gòu)建并培養(yǎng)出其對應(yīng)的膀胱腫瘤干細胞。將腫瘤干細胞傳代至第三代時,提取總RNA,利用PCR技術(shù)檢測,經(jīng)篩選培養(yǎng)后的腫瘤干細胞樣品中腫瘤干細胞經(jīng)典蛋白的mRNA表達水平明顯高于其對應(yīng)親代細胞系中的腫瘤干細胞經(jīng)典蛋白。通過動物實驗發(fā)現(xiàn),腫瘤干細胞成瘤能力明顯強于其對應(yīng)親代細胞系成瘤能力。2.通過轉(zhuǎn)錄組分析和差異表達基因分析,得到共17個差異表達基因,分別是ABCB1、SLC14A1、IL24、IFI44、DDX60、CXCL11、CLEC2B、SCD、RDH10、SLITRK6、PI3、IL7R、PAG1、DHRS3、C3、CDH2、IL8。3.通過TCGA(GEPIA分析平臺)、ONCOMINE等網(wǎng)上公共數(shù)據(jù)庫查詢發(fā)現(xiàn),17個候選差異基因中,只有SCD在膀胱腫瘤和膀胱正常組織中表達差異明顯,同時對膀胱腫瘤患者預后具有不良影響。4.通過細胞功能實驗發(fā)現(xiàn),使用小RNA干擾技術(shù)以及小分子抑制劑處理膀胱腫瘤細胞后,能夠明顯抑制腫瘤細胞的增殖能力,一定程度上抑制膀胱腫瘤細胞的侵襲遷移能力,膀胱腫瘤并不因為SCD因子的抑制而出現(xiàn)凋亡。5.使用小分子抑制劑處理膀胱腫瘤細胞系,將此實驗組和對照組進行轉(zhuǎn)錄組學和脂代謝組學測序檢測。分析發(fā)現(xiàn),SCD抑制劑主要影響的通路為Cell cycle、DNA replication、Cytokine-cytokine receptor interaction、TNF signaling pathway、Fanconi anemia pathway、Homologous recombination、Bladder cancer、p53 signaling pathway。游離脂肪酸中,神經(jīng)酸含量出現(xiàn)了明顯下降。通過在動物模型中,使用SCD小分子抑制劑和神經(jīng)酸灌胃處理,發(fā)現(xiàn)SCD小分子抑制劑組相比空白對照組,腫瘤重量有下降趨勢,神經(jīng)酸灌胃處理組成瘤能力明顯優(yōu)于小分子抑制劑灌胃組。結(jié)論:SCD是膀胱腫瘤干細胞的重要標志物,其高表達與膀胱腫瘤的進展以及不良預后有著重要相關(guān)性。SCD活性的下調(diào)能夠通過調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白,引起細胞周期組織,有效抑制膀胱腫瘤細胞的增殖能力,除此之外,細胞膜功能相關(guān)的通路也出現(xiàn)部分抑制。SCD活性的抑制,使細胞單不飽和脂肪酸合成出現(xiàn)不同程度的減少,其中神經(jīng)酸含量出現(xiàn)明顯下降,動物實驗證明神經(jīng)酸能夠明顯促進腫瘤生長。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.14
【圖文】：

添加了 B27、重組表皮生長因子（EGF）和重組成纖維細胞生長因子（bFGF），后兩者的濃度分別為 20ng/ml 和 10ng/ml。每代腫瘤干細胞培養(yǎng) 7-10 天，然后進行消化傳代。第三代腫瘤干細胞用于細胞干性鑒定以及之后的轉(zhuǎn)錄組芯片分析（圖 1.1）。樣品制備的整過過程需要將近 30 天。將樣本進行轉(zhuǎn)錄組分析之前，我們需要確定所收集的細胞樣品具有干性和自我更新能力。因此，首先我們選取了 5 個與干性相關(guān)的特異性因子包括 CD133, OCT4, NANOG, ABCB1 和ALDH1A1 在我們篩選得到的樣品中進行實時定量 PCR 的檢測。所有這些因子在我們收集到的腫瘤干細胞樣品中全都明顯上調(diào)（圖 1.2）。除此之外，為了進一步驗證細胞干性，我們選擇了小鼠皮下成瘤實驗來檢測腫瘤干細胞的成瘤率，如圖所示，我們將 5637 腫瘤干細胞和 5637 細胞分別注射于 4 周大小的裸鼠皮下，細胞數(shù)分別為 103, 104, 105, 106and 107。在 5-6 周的觀察后，我們比較了兩組細胞成瘤率的差異，我們發(fā)現(xiàn)我們所培養(yǎng)的腫瘤干細胞的成瘤效率較其親代細胞有了明顯的提高（表 1.1）。A B

圖 1.2 腫瘤干細胞干性相關(guān)因子檢測A 圖為 5637 和 5637-CSC 之間腫瘤干細胞干性相關(guān)因子表達量的比較，B 圖為 T24 和 T24-CSC 之間腫瘤干細胞干性相關(guān)因子表達量的比較表 1.1 腫瘤干細胞與普通腫瘤細胞成瘤能力的比較5637-CSC 5637103個細胞 1/6 0/6104個細胞 3/6 0/6105個細胞 5/6 0/6106個細胞 6/6 3/6107個細胞 6/6 5/63.2 膀胱腫瘤干細胞和普通膀胱腫瘤細胞系之間差異基因的篩選

圖 1.3 質(zhì)控和 PCA 主成分分析A 圖為芯片質(zhì)控結(jié)果，B 圖為 PCA 主成分分析A B圖 1.4 5637/T24 與 5637-CSC/T24-CSC 之間差異基因熱圖

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