【摘要】：背景研究發(fā)現(xiàn)隨著終末期腎臟病(End-stage renal disease,ESRD)腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)患者PD時(shí)間的延長(zhǎng),腹膜的形態(tài)和功能將發(fā)生改變,導(dǎo)致腹膜纖維化(Peritoneal fibrosis,PF),最終導(dǎo)致超濾衰竭(Ultrafiltration Failure,UFF)。目前UFF已經(jīng)成為PD患者被迫退出PD的主要原因,因此探討并尋找減輕腹膜纖維化、延緩腹膜透析UFF發(fā)生的方法顯得尤為重要。目的本研究通過(guò)白細(xì)胞介素6(Interleukin-6,IL-6)刺激人腹膜間皮細(xì)胞(Human peritoneal mesothelial cells,HPMCs),誘導(dǎo)HPMCs上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition,EMT),并探討信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活基因3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用。方法體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞,用不同濃度IL-6刺激HPMCs不同時(shí)間,分組:(1)以50μg/L IL-6刺激HPMCs不同時(shí)間,按刺激時(shí)間0h、24h、48h、72 h分組;(2)不同濃度IL-6刺激HPMCs 24小時(shí),按IL-6濃度0μg/L、50μg/L、100μg/L分組;應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)RNA干擾技術(shù)培養(yǎng)并建立穩(wěn)定沉默STAT3基因的HPMCs細(xì)胞株,并將其分組:(1)空白對(duì)照組;(2)IL-6組;(3)空載體組;(4)空載體+IL-6組;(5)慢病毒感染組;(6)慢病毒感染+IL-6組,其中所有加入IL-6組均以50μg/L IL-6刺激HPMCs 24小時(shí)。應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光觀(guān)察技術(shù)檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)和分布。應(yīng)用蛋白印跡法(Western blot)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測(cè)JAK2(Janus kinase 2,JAK2)/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及EMT相關(guān)蛋白和基因表達(dá)。采用SPSS22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果與對(duì)照組相比,隨著IL-6刺激HPMCs時(shí)間延長(zhǎng)及IL-6的濃度增加,E-cadherin蛋白和m RNA(Messenger ribonucleicacid,mRNA)表達(dá)均下降(均P0.05),α-SMA、VEGF(Vascular endothelial growth factor)蛋白和m RNA表達(dá)均升高(均P0.05),通路蛋白p-JAK2/JAK2比值和p-STAT3/STAT3比值均升高(P0.05)。應(yīng)用慢病毒沉默STAT3基因后,與空載體+IL-6組相比,慢病毒感染+IL-6組α-SMA、VEGF蛋白表達(dá)均下降(均P0.05),E-cadherin蛋白表達(dá)上升(P0.05)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果提示,對(duì)照組間皮細(xì)胞之間可見(jiàn)E-cadherin蛋白的表達(dá),胞質(zhì)內(nèi)可少量表達(dá)α-SMA蛋白;與對(duì)照組相比,50μg/L IL-6刺激HPMCs 24小時(shí)后,細(xì)胞膜上E-cadherin蛋白表達(dá)明顯減少,間皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)α-SMA蛋白表達(dá)增加。結(jié)論IL-6可以活化JAK2/STAT3信號(hào)通路參與人腹膜間皮細(xì)胞EMT過(guò)程,并可以刺激HPMC分泌VEGF。應(yīng)用慢病毒沉默STAT3基因后,人腹膜間皮細(xì)胞EMT過(guò)程被抑制。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R692
【圖文】：

綠色熒光代表檢測(cè)的目的蛋白，藍(lán)色熒光代表 HPMC 的細(xì)胞L-6 對(duì) HPMC 中 α-SMA、E-cadherin 表達(dá)的影響（細(xì)胞免疫熒6 對(duì) JAK2/STAT3 信號(hào)通路的影響tern 蛋白印記法結(jié)果顯示，隨著 IL-6 刺激人腹膜間皮細(xì)胞時(shí)間的增加，通路蛋白 p-JAK2 與 JAK2 的比值和 p-STAT3 與 STA與對(duì)照比較均 P＜0.05），證明通路蛋白磷酸化水平升高，見(jiàn)

a注：A：對(duì)照組；B、C：50、100μg/L IL-6 刺激人腹膜間皮細(xì)胞 24 h；與比較，aP＜0.05；n=3圖 3.1 不同劑量 IL-6 刺激對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞 JAK2/STAT3 信號(hào)通路的影（Western 印跡）aaaa

VEGF 的蛋白和 mRNA 表達(dá)升高（與對(duì)照比較均 P＜0.05），見(jiàn)圖4.1，圖 4.2。注：A：Western 印跡；B：實(shí)時(shí)熒光定量 PCR ；A：對(duì)照組；B、C：50、100μg/LIL-6 刺激人腹膜間皮細(xì)胞 24 h；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；n=3圖 4.1 不同劑量 IL-6 刺激 24 h 人腹膜間皮細(xì)胞 EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)aaaaaaaaaaaaAB

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本文編號(hào)：2777175