【摘要】：背景糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最主要的微血管病變之一,病程早期出現(xiàn)腎小球高濾過,而后出現(xiàn)微量白蛋白尿、大量蛋白尿及進(jìn)行性腎功能減退,最終發(fā)展成為終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)。近年來細(xì)胞和分子水平的研究提出了許多糖尿病腎病的病理機(jī)制,主要包括血流動(dòng)力學(xué)改變、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、蛋白激酶C活化、糖基化終末產(chǎn)物生成增多、維生素D受體表達(dá)減少、足細(xì)胞損傷、內(nèi)皮細(xì)胞損傷等。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(glomerular endothelial cells,GEnCs)構(gòu)成腎小球?yàn)V過膜的內(nèi)層,維持腎小球?yàn)V過膜的完整性,對(duì)于阻止尿蛋白漏出、維持正常腎功能均具有重要的意義。高血糖可引起GEnCs損傷,表現(xiàn)為內(nèi)皮通透性增加、舒縮功能障礙及黏附因子表達(dá)上調(diào)等,導(dǎo)致蛋白尿和腎功能受損。據(jù)報(bào)道,高糖誘導(dǎo)下GEnCs可發(fā)生表型轉(zhuǎn)變,表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞表型缺失同時(shí)出現(xiàn)間充質(zhì)細(xì)胞表型,此轉(zhuǎn)換被稱為內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)。近年來,有學(xué)者認(rèn)為糖尿病腎病可能由高血糖激活固有免疫應(yīng)答引起。高糖誘導(dǎo)下,固有免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)家族中的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerization domain 2,NOD2)被激活,引起固有免疫應(yīng)答,導(dǎo)致糖尿病腎病的進(jìn)展。目前關(guān)于NOD2在內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用尚未見報(bào)道,探討NOD2是否參與高糖誘導(dǎo)的GEnCs EndMT對(duì)DN發(fā)病機(jī)制的理解及臨床治療具有重要意義。目的在此研究中,我們培養(yǎng)小鼠GEnCs的條件永生化細(xì)胞系,用高糖加以刺激,模擬人體內(nèi)高血糖環(huán)境,觀察高糖誘導(dǎo)下GEnCs中NOD2及EndMT相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)水平;用NOD2激活劑MDP激活NOD2及用shRNA沉默NOD2表達(dá)以明確NOD2對(duì)高糖誘導(dǎo)的EndMT的影響;用U0126抑制MEK1/2表達(dá)觀察EndMT相關(guān)信號(hào)通路分子的變化,驗(yàn)證MEK/ERK信號(hào)通路是否介導(dǎo)GEnCs EndMT�？傮w而言,我們研究NOD2是否通過MEK/ERK信號(hào)通路介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的GEnCs EndMT。方法1探究高糖誘導(dǎo)下GEnCs中NOD2及End MT相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)變化1.1觀察不同濃度葡萄糖刺激下GEnCs中NOD2的表達(dá)水平。體外培養(yǎng)小鼠GEnCs并分成四組:正常對(duì)照組(葡萄糖5.6mmol/L)、20mmol/L葡萄糖組、40mmol/L葡萄糖組、滲透壓對(duì)照組(5.6mmol/L葡萄糖+34.4mmol/L甘露醇),不同培養(yǎng)基作用24h后進(jìn)行檢測。Western Blot檢測NOD2的蛋白表達(dá)水平,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測NOD2的mRNA表達(dá)水平,免疫熒光(Immunofluorescence,IF)檢測NOD2蛋白在GEn Cs中的定位及分布。1.2觀察高糖不同刺激時(shí)間下GEnCs中EndMT相關(guān)指標(biāo)(內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31、間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA)的表達(dá)水平。對(duì)小鼠GEnCs加以不同時(shí)間的高糖(葡萄糖40mmol/L)刺激,分別為12h、24h。Western Blot檢測高糖刺激下CD31和α-SMA的蛋白表達(dá)水平。2探究NOD2在高糖誘導(dǎo)的GEnCs EndMT中的作用2.1觀察MDP刺激下CD31、α-SMA的表達(dá)水平。對(duì)小鼠GEnCs加以不同時(shí)間的MDP(濃度為2ug/mL)刺激,分別為12h、24h。Western Blot檢測MDP刺激下CD31和α-SMA的蛋白表達(dá)水平。2.2驗(yàn)證NOD2特異性shRNA對(duì)GEnCs的轉(zhuǎn)染效率。將shRNA轉(zhuǎn)染至GEnCs,體外培養(yǎng)小鼠GEnCs并分成三組:正常對(duì)照組、亂序?qū)φ?scramble)組、shRNA干擾組。Western Blot檢測NOD2的蛋白表達(dá)水平。2.3觀察shRNA沉默NOD2表達(dá)后GEnCs中CD31、α-SMA的蛋白表達(dá)水平。將shRNA轉(zhuǎn)染至GEnCs,共分為四組:正常對(duì)照組、高糖組、高糖+scramble組、高糖+shRNA干擾組。Western Blot檢測CD31和α-SMA的蛋白表達(dá)水平。3探究NOD2是否通過MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)下GEnCs EndMT3.1觀察高糖刺激下GEnCs中MEK/ERK信號(hào)通路活性,Western Blot檢測高糖誘導(dǎo)下MEK1/2、磷酸化MEK1/2(p-MEK1/2)的蛋白表達(dá)水平。相對(duì)應(yīng),對(duì)GEnCs加入MEK1/2抑制劑U0126刺激1h,后加入高糖培養(yǎng)24h,分組為:正常對(duì)照組、高糖組、高糖+抑制劑U0126組。Western Blot檢測ERK1/2和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的蛋白表達(dá)水平。3.2觀察高糖刺激下,用shRNA沉默NOD2表達(dá)后,GEnCs中MEK/ERK信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)水平。分組為:scramble組、shRNA干擾組。Western Blot檢測MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白表達(dá)水平。3.3觀察高糖刺激下加入MEK1/2抑制劑U0126后,GEnCs中CD31、α-SMA的表達(dá)水平。分組為:正常對(duì)照組、高糖組、高糖+抑制劑U0126組。Western Blot檢測CD31、α-SMA蛋白表達(dá)水平。IF檢測CD31、α-SMA的細(xì)胞定位和蛋白表達(dá)分布。結(jié)果1.高糖刺激下,GEnCs中NOD2的蛋白及mRNA表達(dá)均升高。用高糖和NOD2激活劑MDP刺激GEnCs,均檢測到內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31表達(dá)下降和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA表達(dá)升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示高糖可能通過激活NOD2以誘導(dǎo)GEnCs間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化。2.轉(zhuǎn)染shRNA至GEnCs后,NOD2表達(dá)下降,提示NOD2特異性shRNA可有效沉默NOD2表達(dá),且shRNA可逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的CD31表達(dá)下降和α-SMA表達(dá)升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),驗(yàn)證NOD2可介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的GEnCs間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化。3.高糖刺激下,磷酸化MEK1/2(p-MEK1/2)及磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表達(dá)增加;用U0126抑制MEK1/2,可降低p-ERK1/2表達(dá);這些結(jié)果顯示高糖誘導(dǎo)下,MEK/ERK途徑被激活。將shRNA轉(zhuǎn)染到GEnCs中,結(jié)果顯示沉默NOD2表達(dá)后p-MEK1/2和p-ERK1/2的表達(dá)顯著降低,提示NOD2參與MEK/ERK信號(hào)通路的激活。應(yīng)用MEK1/2抑制劑U0126處理后,CD31表達(dá)升高、α-SMA表達(dá)下降,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示U0126可逆轉(zhuǎn)NOD2引起的EndMT。這些結(jié)果提示NOD2通過MEK/ERK信號(hào)通路介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)下腎小球內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化。結(jié)論1.高糖誘導(dǎo)下,小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中NOD2表達(dá)增加,CD31表達(dá)下降α-SMA表達(dá)升高。2.沉默NOD2可逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的CD31的下調(diào)和α-SMA的上調(diào)。3.NOD2通過MEK/ERK信號(hào)通路介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)下腎小球內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果 GEnCs 中 NOD2 的表達(dá)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞 GEnCs，并以不同濃度梯度或，蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）結(jié)果顯示：隨延長，NOD2 的蛋白表達(dá)逐漸升高（P<0.05）。

19濃度及不同刺激時(shí)間下 GEnCs 中 NOD2 的 mRN糖刺激下 GEnCs 中 NOD2 的 mRNA 表達(dá) B：高糖間下 GEnCs 中 NOD2 的 mRNA 表達(dá)。*與對(duì)照相小球內(nèi)皮細(xì)胞 GEnCs，并以高糖進(jìn)行刺激 主要分布于細(xì)胞胞漿中，且 NOD2 的蛋白表

20圖 3 高糖刺激下 GEnCs 中 NOD2 的定位及表達(dá)注：HG:高糖（40 mmol/L 葡萄糖）；Nucleus：細(xì)胞核；Merge：融合。糖和 MDP 刺激下 GEnCs EndMT 相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)2.1 體外培養(yǎng)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞 GEnCs，并以不同時(shí)間梯度的高糖進(jìn)行ern Blot 結(jié)果顯示：隨著刺激時(shí)間的延長，CD31 的蛋白質(zhì)表達(dá)逐漸下A 的蛋白表達(dá)量逐漸升高（P<0.05）。見圖 4A、B、C。

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本文編號(hào)：2772700