【摘要】：研究背景長鏈非編碼RNA(LncRNA)是指序列長度大于200個核苷酸、但無編碼蛋白功能的一類RNA。LncRNA在多種惡性腫瘤中存在異常表達,并參與了對腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控作用。目前關(guān)于膀胱癌中LncRNA的研究尚不多,其可能的作用機制仍不清楚。目的了解膀胱癌中LncRNA的表達情況,探索LncRNA-linc00346對膀胱癌細胞生物學(xué)行為的影響,并揭示其可能的作用機制。方法1.在6對膀胱癌及癌旁正常膀胱組織標本中進行基因芯片檢測,觀察LncRNA的差異表達情況,采用qRT-PCR驗證基因芯片結(jié)果,并進行基因功能和信號通路等生物信息學(xué)分析,構(gòu)建差異基因共表達網(wǎng)絡(luò)。2.根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果,選出linc00346作為目標LncRNA進行深入研究。通過qRT-PCR在52例臨床膀胱癌組織標本和膀胱癌T24、SW780細胞系中再次驗證linc00346的差異表達情況。3.應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA技術(shù)沉默linc00346在膀胱癌T24和SW780細胞系中的表達,然后進行一系列細胞功能試驗,通過CCK-8實驗、克隆形成實驗、Transwell實驗、流式細胞術(shù)、Western Blot、裸鼠移植瘤模型等來研究沉默linc00346表達對膀胱癌細胞系生物學(xué)行為的影響。4.通過Western blot檢測沉默linc00346后T24和SW780細胞系中PI3K/Akt通路PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表達變化情況,并加入PI3K/Akt通路抑制劑LY294002進行進一步驗證,初步探索linc00346影響膀胱癌細胞的機制。結(jié)果1.經(jīng)過基因芯片篩選,得到了差異表達LncRNA共2548條(FC值2.0),其中在膀胱癌中表達上調(diào)的1539條,下調(diào)的1009條;明顯表達差異(FC值10)的LncRNA上調(diào)的有126條,下調(diào)的有103條。生物信息學(xué)分析顯示LncRNAs和rmRNAs之間存在著密切的共表達關(guān)系,并選出了在膀胱癌中顯著表達上調(diào)的linc00346進行功能及機制研究。2.linc00346在膀胱癌組織中表達水平較其癌旁正常組織明顯上調(diào),膀胱癌T24和SW780細胞系中l(wèi)inc00346的表達量均顯著高于對照的正常人膀胱上皮HUM-CELL-0046細胞系。3.CCK-8、克隆形成實驗、Ki67免疫組化、裸鼠移植瘤實驗結(jié)果顯示沉默linc00346可以抑制膀胱癌細胞的增殖能力;流式細胞術(shù)、Western blot檢測發(fā)現(xiàn)沉默linc00346可以影響膀胱癌細胞周期,使腫瘤細胞停滯于G0/GI期,并加劇腫瘤細胞的凋亡;Transwell侵襲實驗結(jié)果提示沉默linc00346能夠削弱膀胱癌細胞的遷移及侵襲能力。4.沉默linc00346能夠顯著降低PI3K、Akt的磷酸化水平,即減弱了PI3K/Akt通路的激活。聯(lián)合應(yīng)用PI3K/Akt通路抑制劑LY294002時,其對PI3K、Akt磷酸化的抑制作用更加顯著。結(jié)論1.膀胱癌組織中存在大量差異表達的LncRNAs,這些異常表達的LncRNAs可能與膀胱癌的發(fā)生和進展有關(guān)。2.linc00346在膀胱癌中表達顯著上調(diào),并且能夠促進膀胱癌細胞增殖、減少細胞凋亡、增加癌細胞侵襲性和腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。3.linc00346可能是通過激活PI3DK/Akt通路磷酸化來對膀胱癌細胞產(chǎn)生影響的。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.14
【圖文】：

針信號進行統(tǒng)一標準化處理，目的是使芯片的基礎(chǔ)熒光信號強度達成同步一致，逡逑從而避免了因基礎(chǔ)熒光信號存在差別而導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)誤差或差錯的情況發(fā)逡逑生。１２個樣本經(jīng)過標準化和對數(shù)轉(zhuǎn)換后繪制成箱線圖，如圖１－２所示，１２個樣逡逑本的芯片熒光信號強度一致，提高了實驗數(shù)據(jù)對比的可信度。逡逑Ｉ１０＇邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐Ｍ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐！邐ｉ逡逑１逡逑—邐灥W邐■逡逑－－逡逑Ｉ邐１邐Ｉ邐１邐Ｉ邐１邐１邐Ｉ邐Ｉ邐１邐？逡逑Ｉ邐１邐ｔ邐１邐瞻邐《邐？邐．邐Ｊ邐１邐Ｉ逡逑NNN邐NNN邐NNN邐NNN逡逑ｉｌｉｇｌｔｓｓｓｉｓ邋ｓ逡逑Ｓａｍｐｌｅ逡逑圖１－２芯片箱線圖逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋ｂｏｘ－ａｎｄ－ｗｈｉｓｋｅｒ邋ｐｌｏｔ邋ｆｏｒ邋ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ逡逑然后檢測各樣本中ＬｎｃＲＮＡ表達譜的差異性（圖１－３）；將篩選得到的差異逡逑表達基因，通過聚類熱圖、散點圖及火山圖等直觀的圖形進行展示。逡逑１９逡逑

圖１－３各樣本中ＬｎｃＲＮＡ表達譜差異逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋ＬｎｃＲＮＡ邋Ｃｈｉｐ邋ｓｃａｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓａｍｐｌｅｓ逡逑①差異基因聚類熱圖（圖１－４）逡逑聚類熱圖是對樣本和基因各自分別進行分級聚類之后，通過熱圖的形式來逡逑表現(xiàn)基因在不同樣本中的表達情況。橫坐標是樣本名稱，樣本按照計算所得到逡逑的距離遠近值來進行排序；縱坐標是探針號或基因名稱。因而聚類分析圖表示逡逑各組織樣本中ＬｎｃＲＮＡ的表達量差異越大，則它們所處的位置的間距就越遠。逡逑２０逡逑

圖１－５各樣本ＬｎｃＲＮＡ表達散點圖逡逑Ｆｉｇ．邋１－５邋Ｔｈｅ邋ｓｃａｔｔｅｒ－ｐｌｏｔ邋ｏｆ邋ＬｎｃＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｓａｍｐｌｅｓ逡逑③火山圖（圖１－６）逡逑從基因芯片結(jié)果數(shù)據(jù)中篩選出顯著性差異表達的ＬｎｃＲＮＡ，需設(shè)定差異倍數(shù)逡逑（Ｆｏｌｄ邋Ｃｈａｎｇｅ值）和ｔ－檢驗得到的Ｐ－ｖａｌｕｅ值這兩個條件，火山圖可以展不出滿逡逑足上述兩條件的差異ＬｎｃＲＮＡ數(shù)目以及這些ＬｎｃＲＮＡ在同一平面內(nèi)的分布情況。逡逑在火山圖里，橫坐標為ｌｏｇ２（Ｆｏｌｄ邋Ｃｈａｎｇｅ），縱坐標為－ｌｏｇｌＯ（Ｐ－ｖａｌｕｅ），基因表達逡逑的上調(diào)或下調(diào)用正負號表示。逡逑２２逡逑

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本文編號：2771982