【摘要】：研究背景及目的：前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,在全球范圍內(nèi)已經(jīng)成為男性第二大類常見腫瘤,位于癌癥相關(guān)死亡率第六位,嚴重危害中老年男性健康。前列腺癌的發(fā)病率及死亡率存在很大的地域差異,在美國已成為發(fā)病率及死亡率第一位的惡性腫瘤,在亞洲國家前列腺癌的發(fā)病率仍處于較低水平。隨著社會人口的老齡化及診斷篩查技術(shù)的進步,我國前列腺癌發(fā)病率在逐年提高,已位于男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位,僅次于膀胱癌和腎癌。目前,對前列腺癌的篩查診斷主要依靠血清PSA檢測及前列腺穿刺病理活檢,但因PSA具有診斷敏感性及特異性不高,不能判別進展性和惰性前列腺癌等缺點,從而導(dǎo)致不必要的前列腺穿刺活檢及前列腺癌的過度治療。因此,研究更有效的前列腺癌標記物對提高前列腺癌的早期診斷及為患者制定合理的個體化治療方案,減少前列腺癌患者死亡率和改善生活質(zhì)量有重要的意義。前列腺癌的病因及發(fā)病機制尚未完全清楚。既往人們對前列腺癌發(fā)病機制的研究大部分集中于前列腺癌細胞,認為前列腺癌的發(fā)生主要是前列腺上皮細胞基因突變的結(jié)果,上皮細胞癌基因激活和抑癌基因失活是前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)。目前認為前列腺癌的形成是遺傳、炎癥、環(huán)境等多因素綜合作用的結(jié)果,涉及一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程,包括正常上皮細胞向腫瘤細胞轉(zhuǎn)變、上皮-間質(zhì)細胞的相互作用、腫瘤的生長及局部侵犯、遠處轉(zhuǎn)移等。研究已證實腫瘤間質(zhì)微環(huán)境的改變是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個共同特征,腫瘤-間質(zhì)的相互作用在腫瘤的進展中扮演著重要的作用,腫瘤間質(zhì)成分的改變可以破壞正常前列腺微環(huán)境的內(nèi)穩(wěn)態(tài)并影響腫瘤細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能夠?qū)е履[瘤細胞的凋亡能力減弱、化療耐藥能力增強,成為晚期腫瘤治療失敗的重要原因。深入研究前列腺癌間質(zhì)在前列腺癌發(fā)病機制及疾病轉(zhuǎn)歸的作用,將對前列腺癌的防治產(chǎn)生深遠的影響。蛋白質(zhì)組學(xué)是上世紀90年代發(fā)展起來的研究生物體蛋白質(zhì)的一門新興學(xué)科,是繼基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)之后的又一個細胞生物學(xué)高通量研究方法。能大規(guī)模研究蛋白質(zhì)的特征,包括蛋白質(zhì)的表達水平、翻譯后的修飾、不同蛋白質(zhì)間的相互作用等。由于蛋白質(zhì)是基因功能的直接執(zhí)行者,蛋白質(zhì)組學(xué)研究可揭示生物體蛋白質(zhì)改變與機體疾病發(fā)生的關(guān)系,為闡明疾病的發(fā)病機制提供直接的依據(jù)。蛋白質(zhì)組學(xué)因其通量高、分辨率和重復(fù)性好以及可與質(zhì)譜聯(lián)用的特點,已成為研究腫瘤標記物和藥物靶標最有效的方法之一,在腫瘤的臨床診斷和治療方面有十分誘人的前景。本研究通過激光捕獲顯微切割結(jié)合蛋白組學(xué)技術(shù)檢測前列腺癌與癌旁良性組織的差異表達蛋白,并利用生物信息學(xué)工具對差異表達蛋白進行聚類分析,篩選其中在前列腺癌間質(zhì)表達的基因。選取差異表達最明顯的間質(zhì)表達基因MYL9,利用實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)進一步驗證其在前列腺癌及非癌組織的差異表達,再通過大樣本組織芯片免疫組化檢測MYL9在前列腺癌的表達模式,驗證基于蛋白組學(xué)結(jié)果篩選前列腺癌間質(zhì)標記物的可靠性。結(jié)合前列腺組織芯片樣本相關(guān)臨床病理數(shù)據(jù)和Taylor數(shù)據(jù)庫,統(tǒng)計分析前列腺癌間質(zhì)MYL9表達與前列腺癌臨床病理分期、血清PSA水平、無生化復(fù)發(fā)生存率和總體生存率等臨床病理特征的關(guān)系,研究前列腺癌間質(zhì)MYL9表達在前列腺癌進展和預(yù)后評估中的作用。本研究希望能發(fā)現(xiàn)前列腺癌間質(zhì)特異性標記物,為前列腺癌上皮-間質(zhì)相互作用機制的研究提供一定的依據(jù),并為前列腺患者的治療提供潛在的間質(zhì)靶標。研究材料：1：用于蛋白質(zhì)組學(xué)檢測的4例前列腺癌及配對癌旁前列腺組織來源于廣州市第一人民醫(yī)院2012年5月至2012年8月行根治性前列腺切除并雙側(cè)盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的前列腺癌病人,患者年齡介乎于54至70歲,均屬于T2NOMO分期。用于Western Blot檢測的20例前列腺癌及配對癌旁前列腺冰凍組織取自廣州市第一人民醫(yī)院2008至2013年行前列腺癌根治術(shù)的前列腺標本,患者年齡介乎于56-68歲(平均61.31±5.65歲)。用于RT-qPCR的40對前列腺癌及良性癌旁石蠟組織受贈于美國哈佛大學(xué)麻省總醫(yī)院病理實驗室組織庫,這些標本是2012年行前列腺癌根治術(shù)或經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)(TURP)的前列腺組織,患者年齡介乎于58-83歲(平均67.10±6.95),其中高分化前列腺癌12例,中分化15例,低分化13例。2：含有99例前列腺癌和81例良性前列腺組織樣本的組織芯片購買于上海芯超生物科技有限公司(Cat No:HPro-Ade180PG-01)。前列腺癌患者平均年齡70.71±7.99歲,其中血清PSA≥4nmol/ml的有87例、Gleason≥8的有28例。3. Taylor數(shù)據(jù)庫包含149例原發(fā)性前列腺癌及29例良性癌旁組織樣本的mRNAs水平及詳細臨床病理資料。本研究由廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準,所用組織樣本的處理均符合倫理及法律法規(guī)。所有標本獲取的前列腺癌患者術(shù)前均未接受放射治療、化療或內(nèi)分泌治療。研究方法：1：收集4例新鮮前列腺癌及其配對癌旁樣本并冰凍保存,通過激光捕獲顯微切割技術(shù)獲取較純的前列腺癌和癌旁組織。提取并純化前列腺癌及癌旁組織的蛋白質(zhì),經(jīng)雙向凝膠電泳→凝膠掃描成像分析以獲得各蛋白質(zhì)含量的數(shù)據(jù),并對所得數(shù)據(jù)進行配對t檢驗,發(fā)現(xiàn)差異表達明顯的蛋白質(zhì)(差異表達倍數(shù)高于2)。再通過凝膠染色→差異蛋白質(zhì)點切割→膠內(nèi)酶解→質(zhì)譜分析明確差異表達蛋白質(zhì)的種類。2：利用人類蛋白質(zhì)圖集數(shù)據(jù)庫http://www.proteinatlas.org (HPA)、 http://www.pantherdb.org數(shù)據(jù)庫及http://www.string-db.org數(shù)據(jù)庫,對蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)的差異表達蛋白進行聚類分析及蛋白質(zhì)相互作用分析,篩選出前列腺癌間質(zhì)基因。3：選取前列腺癌差異表達最明顯的間質(zhì)基因,通過RT-qQPCR檢測其在40對前列腺癌及癌旁組織的mRNA表達,Western Blot檢測其在20對前列腺癌及癌旁組織的蛋白質(zhì)表達,進一步驗證該基因在前列腺癌及癌旁組織的差異表達情況。4：對大樣本前列腺組織芯片進行免疫組化染色評分,檢測所選取的間質(zhì)基因在前列腺癌的表達模式,并分析其表達水平與前列腺癌PSA、Gleason評分、臨床病理分期和疾病轉(zhuǎn)移的關(guān)系。5：利用Taylor數(shù)據(jù)庫分析間質(zhì)基因表達水平與前列腺癌生化復(fù)發(fā)和總體生存率的關(guān)系,并分析該基因與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標記蛋白E-cadherin、Vimentin的相關(guān)性,研究其在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及可能機制。統(tǒng)計學(xué)處理：全部資料均采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。正態(tài)分布計量資料用均數(shù)±標準差表示,兩組配對計量資料的均數(shù)比較采用配對t檢驗,非配對計量資料采用獨立樣本t檢驗。前列腺癌不同間質(zhì)比例組間基因免疫組化評分比較采用Kruskal-Wallis檢驗,并進行Spearman相關(guān)分析。候選間質(zhì)基因與E-cadherin等其他前列腺癌上皮間質(zhì)指標的表達量關(guān)系用Pearson相關(guān)分析。生存分析第一終點事件是生化復(fù)發(fā),第二終點事件是患者死亡。Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗研究間質(zhì)基因表達水平對前列腺癌生化復(fù)發(fā)和總體生存率的影響。用單因素及多因素COX回歸比例風(fēng)險模型分析前列腺癌間質(zhì)基因表達與生化復(fù)發(fā)及死亡的風(fēng)險比,研究間質(zhì)基因能否作為前列腺癌生化復(fù)發(fā)和死亡的獨立預(yù)測因素。統(tǒng)計結(jié)果P值小于0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：1：蛋白質(zhì)組學(xué)檢測4對前列腺癌和對應(yīng)癌旁組織的蛋白質(zhì)差異表達情況。雙向凝膠電泳及凝膠掃描成像分析,發(fā)現(xiàn)在前列腺癌組織中差異表達倍數(shù)大于2的蛋白質(zhì)點共有155個,其中66個蛋白點明顯下調(diào),89個蛋白點明顯上調(diào)。通過凝膠染色,切取差異蛋白點進行膠內(nèi)酶解及質(zhì)譜分析,共鑒定出66個蛋白質(zhì),其中40個呈上調(diào)表達,26個呈下調(diào)表達,其中MMC2上調(diào)表達最明顯(Average Ratio:4.29; P=0.023), MYL9下調(diào)表達最明顯(Average Ratio:-5.67; P=0.008)。2：通過HPA數(shù)據(jù)庫對蛋白組學(xué)所鑒定的66個前列腺癌差異表達蛋白在前列腺癌組織中的表達模式進行檢索分析,發(fā)現(xiàn)主要在前列腺癌間質(zhì)中表達而癌細胞陰性或弱陽性表達的間質(zhì)基因14個,其中MYL9、LPP、CKB、GSTM2、GSTP1、 DPYSL3、ACTC1、GSTM3、PRPH呈下調(diào)表達,FGB、ACY1、VCL、HSPB1、MSN呈上調(diào)表達。3：進一步通過http://www.pantherdb.org數(shù)據(jù)庫和http://www.string-db.org數(shù)據(jù)庫進行基因功能分析及基因關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)14個間質(zhì)基因參與細胞粘附結(jié)合、細胞免疫、細胞代謝等功能,并涉及VEGF、Wnt等信號通路的調(diào)控,間質(zhì)基因相互關(guān)聯(lián)不明顯。我們選取在前列腺癌中差異下調(diào)表達最明顯的MYL9進一步研究其在前列腺癌表達的臨床意義。4:RT-qPCR檢測MYL9在40對前列腺癌及對應(yīng)的癌旁良性組織石蠟樣本中的mRNA差異表達情況。發(fā)現(xiàn)MYL9在前列腺癌組織中的相對表達量為1.30±0.63,顯著低于對應(yīng)的癌旁組織中的相對表達量為1.91±0.70(P0.001),提示MYL9在前列腺癌中的表達明顯下調(diào),與蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)結(jié)果相符。5:Western Blot檢測MYL9在20對前列腺癌與癌旁組織中的蛋白質(zhì)差異表達。結(jié)果顯示MYL9表達量在前列腺癌組織中顯著低于癌旁組織(前列腺癌=0.23±0.08,癌旁=0.73±0.06,P0.001)。6：大樣本前列腺組織芯片免疫組化結(jié)果顯示MYL9在前列腺癌及良性前列腺組織中均主要表達于間質(zhì)細胞的細胞質(zhì),在正常前列腺上皮細胞及前列腺癌細胞呈陰性表達。MYL9在前列腺癌組織中的表達明顯低于良性癌旁組織(IRS: PCa=3.36±1.58 vs. Benign=4.85±1.02, P0.001)。MYL9的表達水平與前列腺癌的臨床分期呈顯著負相關(guān)(r=-0.550,P0.001)。7:Kaplan-Meier生存分析顯示MYL9表達量與前列腺癌無生化復(fù)發(fā)生存率及總體生存率表現(xiàn)為顯著相關(guān)性(P值分別為0.001和0.012),前列腺癌間質(zhì)中MYL9表達水平越高,則患者無生化復(fù)發(fā)生存率及總體生存率越高。Cox比例風(fēng)險回歸模型提示MYL9是一個能預(yù)測前列腺癌患者生化復(fù)發(fā)(HR=0.53,95%CI: 0.30～0.74)和死亡(HR=0.06,95%CI:0.01～0.45)的獨立影響因素。8：MYL9與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及間質(zhì)標記性蛋白E-cadherin、Vimentin、TGF-β1和α-SMA的Pearson相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)MYL9表達與E-cadherin呈顯著相關(guān)(r=0.949,P0.001),與α-SMA、TGF-β1及Vimentin也有相關(guān)性(r=0.301, P=0.014; r=0.360, P0.001; r=0.336, P0.001)。提示前列腺癌間質(zhì)中MYL9表達可能與前列腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及間質(zhì)重構(gòu)有關(guān)。結(jié)論：1、蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)前列腺癌差異表達蛋白質(zhì),結(jié)合生物信息學(xué)分析可以有效篩選前列腺癌間質(zhì)生物標記物,為研究前列腺癌間質(zhì)成分在前列腺癌進展中的作用機制提供線索。2、MYL9在前列腺癌間質(zhì)中的表達顯著低于良性癌旁組織,其下調(diào)表達參與前列腺癌的形成及進展。3、前列腺癌組織MYL9表達與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān),根據(jù)MYL9表達水平可判斷前列腺癌的惡性程度。4、MYL9可以作為預(yù)測前列腺癌患者總體生存率和無生化復(fù)發(fā)生存率的一個獨立指標,并是前列腺癌治療的一個潛在間質(zhì)靶標。5、前列腺癌間質(zhì)MYL9下調(diào)表達可能通過誘導(dǎo)腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及前列腺癌間質(zhì)重構(gòu),促進前列腺癌的進展。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25
【圖文】：

間質(zhì)成分包括成纖維細胞（加ｒｏｂｌａｓｔ）、膠原細胞、平滑肌細胞、挪巴逡逑免疫細胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細胞、血管、淋己管、神經(jīng)突觸、細胞外基質(zhì)和存在于逡逑細胞外基質(zhì)中的多種生長因子及調(diào)節(jié)因子、基質(zhì)重構(gòu)酶等口］，（圖２）。逡逑Ｅ？一邋？邋ＵｆＴｉｍａ逡逑ｙ邐Ｂｌｏｏｄ邋ＶｅｓＭｔ逡逑－酒Ｖ－逡逑

本文編號：2770574