【摘要】：第一章去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞中E2F1調(diào)控的重要基因和通路去勢(shì)抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer,CRPC)是前列腺癌治療的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。E2F轉(zhuǎn)錄因子1(E2F1)是CRPC中的一個(gè)重要因子,本研究的主要目的是發(fā)現(xiàn)E2F1通過(guò)調(diào)控哪些基因和通路來(lái)影響CRPC的細(xì)胞學(xué)行為。通過(guò)shRNA技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)敲低E2F1的CRPC細(xì)胞株P(guān)C3和DU145。采用流式細(xì)胞術(shù)、CCK8、transwell等方法檢測(cè)細(xì)胞(敲低E2F1的PC3和DU145)細(xì)胞學(xué)功能。用RNA-seq(RNA-sequencing)檢測(cè)敲低E2F1后細(xì)胞基因的表達(dá)水平,找到差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)。使用GeneMANIA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因共表達(dá)分析,GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相關(guān)性分析。通過(guò)Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行差異表達(dá)基因的通路富集。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape軟件篩選Hub基因。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和GEPIA等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。敲低E2F1抑制PC3細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡,但對(duì)DU145細(xì)胞則無(wú)該影響。敲低E2F1均能降低PC3和DU145細(xì)胞的侵襲和遷移能力。敲低E2F1后,PC3細(xì)胞鑒定出了1811個(gè)DEGs,其中800個(gè)基因出現(xiàn)上調(diào),1011個(gè)基因出現(xiàn)下調(diào)。而敲低DU145細(xì)胞的E2F1后出現(xiàn)27個(gè)差異表達(dá)基因,包括6個(gè)基因上調(diào)和21個(gè)基因下調(diào)。獲得這兩個(gè)細(xì)胞的overlapped DEGs,包括CFH、IL1RL1、EVA1C、TMOD2、AIF1L、WIPF3、NXPH4、KREMEN2、PI3和E2F1�；蚬脖磉_(dá)分析顯示,KREMEN2和TMOD2分別與E2F1共表達(dá),獨(dú)立于其他的overlapped DEG。相關(guān)分析說(shuō)明CFH,IL1RL1,EVA1C,WIPF3,NXPH4,KREMEN2與E2F1正相關(guān)。PC3和DU145組的overlapped DEG僅富集在一個(gè)通路上:肌動(dòng)蛋白絲組織通路(actin filament organization)。對(duì)PC3組進(jìn)行模塊分析獲得總共有153個(gè)node和624個(gè)edge。篩選出10個(gè)hub DEGs,包括CCL2、FGF2、TLR2、CDH1、PTGS2、SHH、C3、VEGFA、PECAM1和CXCR4。此外,還找到了PC3中的一些其他重要的DEGs,包括NOTCH3、BID和STAT1。RT-qPCR驗(yàn)證了兩株細(xì)胞的5個(gè)overlapped DEGs,PC3細(xì)胞的3個(gè)DEGs。EVA1C、IL1RL1和PTGS2可作為前列腺癌的潛在診斷標(biāo)志物。E2F1通過(guò)改變CRPC中一些基因如TMOD2的表達(dá)水平,在調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲組織通路中起著至關(guān)重要的作用,繼而改變CRPC細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)功能。第二章E2F1的敲除對(duì)前列腺癌細(xì)胞功能的影響及前列腺癌中E2F1調(diào)控機(jī)制的研究通過(guò)前期構(gòu)建的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)E2F1可能受到多個(gè)上游基因的調(diào)控,也調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)。然而,E2F1在前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)細(xì)胞調(diào)控的基因并不明確,并且缺乏E2F1負(fù)調(diào)控下一基因的報(bào)道。因此,我們?cè)噲D找到敲除E2F1對(duì)PCa細(xì)胞學(xué)功能的影響以及E2F1在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上調(diào)控哪些重要的基因。通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建敲除E2F1的PC3細(xì)胞。采用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)E2F1在細(xì)胞中的敲除效果。流式細(xì)胞術(shù)、CCK8、transwell檢測(cè)細(xì)胞的凋亡、增殖、遷移和侵襲。并結(jié)合RNA-seq結(jié)果,分析前列腺癌細(xì)胞中E2F1的Ch IP-seq結(jié)果,找到受到E2F1正負(fù)調(diào)控的基因。RT-q PCR驗(yàn)證這些基因。運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建敲除E2F1的PC3細(xì)胞株。敲除E2F1后的PC3細(xì)胞增殖能力顯著降低(P0.01),對(duì)PC3細(xì)胞凋亡水平?jīng)]有顯著影響(P0.05),敲除E2F1后的PC3細(xì)胞侵襲能力顯著降低(P0.01),敲除E2F1后的PC3細(xì)胞遷移能力極顯著降低(P0.001)。上一章中10個(gè)overlapped基因,包括TMOD2,AIF1L,CFH,IL1RL1,EVA1C,WIPF3,NXPH4,KREMEN2和PI3均可以與E2F1結(jié)合。證實(shí)了E2F1可以通過(guò)調(diào)節(jié)TMOD2和AIF1L參與細(xì)胞肌動(dòng)蛋白組織以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架。RT-q PCR驗(yàn)證了PC3細(xì)胞中E2F1的敲除能夠顯著下調(diào)TMOD2和AIF1L,上調(diào)CFH,IL1RL1和EVA1C的表達(dá)。敲除E2F1后,CFH,IL1RL1和EVA1C表達(dá)水平升高,證明在PCa中確實(shí)存在可以被E2F1負(fù)調(diào)控的靶基因。一方面,證實(shí)了E2F1可以通過(guò)調(diào)節(jié)TMOD2和AIF1L參與調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白以影響細(xì)胞骨架,繼而影響細(xì)胞學(xué)功能。另一方面,填補(bǔ)了E2F1負(fù)調(diào)控下一基因這一空白,完善了前列腺癌中E2F1的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。第三章基于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的前列腺癌細(xì)胞中多靶點(diǎn)聯(lián)合干擾的研究前列腺癌(Prostate Cancer)患者經(jīng)進(jìn)一步去勢(shì)和/或抗雄激素藥物治療一段時(shí)間后,大部分發(fā)展成為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer,CRPC)。我們前期研究通過(guò)文本挖掘構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的負(fù)反饋環(huán)發(fā)現(xiàn),如果我們同時(shí)控制E2F1、MEK和NF-κB三個(gè)靶點(diǎn),將有效地控制雄激素受體(Androgen Receptor,AR)的表達(dá),這將為CRPC的治療提供有意義聯(lián)合治療靶點(diǎn)。通過(guò)sh RNA技術(shù)構(gòu)建敲低E2F1的穩(wěn)轉(zhuǎn)非雄激素依賴(lài)CRPC細(xì)胞株P(guān)C3、DU145和雄激素依賴(lài)PCa細(xì)胞株LNCa P。使用蛋白免疫印跡技術(shù)和免疫熒光技術(shù)分別檢測(cè)抑制劑對(duì)MEK和NF-κB的抑制效果。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、CCK-8、transwell檢測(cè)E2F1、MEK和NF-κB三個(gè)靶點(diǎn)的聯(lián)合干擾對(duì)三株細(xì)胞凋亡、增殖、遷移和侵襲方面的影響。熒光定量PCR技術(shù)(RTq PCR)檢測(cè)三個(gè)靶點(diǎn)的聯(lián)合干擾對(duì)腫瘤行為相關(guān)基因(MMP2、VEGFA、CDH1、BCL-2)表達(dá)的影響。由RNA-sequencing(RNA-seq)結(jié)果分析CRPC細(xì)胞的差異表達(dá)基因(Different expression genes,DEGs),通過(guò)DEGs的通路富集分析以找到聯(lián)合干擾三個(gè)靶點(diǎn)后哪些重要的通路等發(fā)生了變化。通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析找到主要發(fā)生改變的模塊。通過(guò)hub基因(hub gene)的獲得以了解聯(lián)合干擾后什哪些關(guān)鍵基因發(fā)生了改變。20μM PD0325901和5μM SC75741作用48h,可以對(duì)敲低E2F1的CRPC細(xì)胞的MEK和NF-κB產(chǎn)生良好的抑制效果。對(duì)三個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合干擾后,PC3、DU145和LNCa P三株細(xì)胞的增殖能力極顯著降低(P0.001),且低于加入CRPC治療的臨床藥物阿比特龍的陽(yáng)性對(duì)照組。聯(lián)合干擾后,PC3(P0.001)和DU145(P0.05)細(xì)胞的侵襲能力下降,且低于陽(yáng)性對(duì)照組。聯(lián)合干擾可以使PC3(P0.001)、DU145(P0.05)和LNCa P(P0.001)細(xì)胞的遷移能力下降,且低于陽(yáng)性對(duì)照組;聯(lián)合干擾三株細(xì)胞,顯著增強(qiáng)細(xì)胞的凋亡(P0.001),且高于陽(yáng)性對(duì)照組。聯(lián)合干擾后,PC3細(xì)胞的MMP2基因表達(dá)水平極顯著表達(dá)上調(diào)(P0.001),DU145細(xì)胞的MMP2基因則出現(xiàn)了極顯著下調(diào)的情況(P0.001)。聯(lián)合干擾后VEGFA、BCL-2、CDH1三個(gè)基因表達(dá)水平,在PC3、DU145細(xì)胞中均出現(xiàn)顯著或極顯著下調(diào)(P0.01或P0.001),且表達(dá)水平均低于陽(yáng)性對(duì)照組。聯(lián)合干擾后PC3細(xì)胞出現(xiàn)的745個(gè)DEGs,其中316個(gè)基因上調(diào),429個(gè)基因下調(diào)。DEGs富集在包括細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、病毒防御反應(yīng)通路、前期染色體的凝結(jié)通路、趨化性通路和細(xì)胞分裂通路等重要的通路上。發(fā)差異表達(dá)基因?qū)?xì)胞的影響主要包括4個(gè)主要的簇狀通路:影響染色體的通路,關(guān)于趨化性的通路、關(guān)于干擾素的通路以及關(guān)于細(xì)胞行為的通路等。找到包括IL6、BIRC5、CDH1、PLK1、CDK1、CDC20等基因在內(nèi)的20個(gè)hub基因。與正常組織相比,BIRC5、CCNB1、CDC20、CDH1、TOP2A和UBE2C基因在前列腺癌組織中出現(xiàn)了差異表達(dá)的情況,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。BIRC5、CCNA2、KIF2C、PLK1和CDC20與前列腺癌患者的總生存率相關(guān),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(8)BIRC5和CDC20在差異表達(dá)和生存分析中均有顯著差異,有望成為前列腺癌診斷、預(yù)后的新指標(biāo)。E2F1、MEK和NF-κB三個(gè)靶點(diǎn)的聯(lián)合干擾抑制CRPC細(xì)胞PC3、DU145,甚至是雄激素依賴(lài)細(xì)胞LNCa P的增殖、侵襲和遷移,促進(jìn)他們的凋亡,顯著下調(diào)多個(gè)腫瘤行為相關(guān)基因,這將為CRPC的治療提供有意義聯(lián)合治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R737.25
【圖文】：

在兩種細(xì)胞系中， E2F1 表達(dá)確實(shí)已經(jīng)被抑制，敲低 E2F1 的 CRPC 細(xì)胞株已經(jīng)成功構(gòu)建。（P < 0.001，圖1-1C，D）。圖 1-1 構(gòu)建敲低 E2F1 的 PC3 和 DU145 細(xì)胞Figure 1-1 The construction of PC3 and DU145 cells by the downregulating of E2F1 expression.The phenotypic characterization of PC3 (A) and DU145 (B) groups; ‘vector’, empty vector as negativecontrol; ‘shE2F1’, shRNAfor E2F1. The expression of the E2F1 was suppressed by shE2F1 in PC3(C) andDU145 (D). Statistical significance was calculated using an independent-sample t-test. *p<0.05, **p<0.01.為了研究 E2F1 對(duì) CRPC 細(xì)胞功能的影響，我們檢測(cè)了敲低 E2F1 后DU145 和 PC3 細(xì)胞的凋亡、增殖、遷移和侵襲。如圖 1-2A 所示，對(duì)于PC3_vector、PC3_shE2F1 細(xì)胞，早期細(xì)胞凋亡從 1.4％增加至 22.3％，而晚期細(xì)胞凋亡從 0.5％增加至 4.6％，最顯著的變化發(fā)生在早期凋亡階段（P <0.001）。與之相比，在 DU145 細(xì)胞中

圖 1-2 構(gòu)建敲低 E2F1 的 PC3 和 DU145 細(xì)胞的細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)Figure 1-2 The cellular function of PC3 and DU145 cells with knock-down of E2F1Flow cytometry study of PC3 and DU145 groups stained withAnnexin VAPC/7-AAD (A). PC3 (B) andDU145 (C) proliferation level detected by CCK-8 kit. PC3 cell migration (D) and invasion (E) and DU145cell migration (F) and invasion (G) were detected using transwell assays. Statistical significance wascalculated using an independent-sample t-test. *P<0.05, **P<0.01.3.2 E2F1 基因敲低后 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)的基本情況為了研究在 CRPC 中 E2F1 的分子調(diào)控機(jī)制，使用 RNA-seq 分析了敲低 E2F1 后 PC3 和 DU145 細(xì)胞及其對(duì)照的轉(zhuǎn)錄譜。共有 12 個(gè)測(cè)序樣本，每組有 3 個(gè)重復(fù)。每組樣本（包括 PC3_vector、DU145_vector、PC3_shE2F1和 DU145_shE2F1 組）的重復(fù)的 致性良好（圖 1-3A、1-3B）。

圖 1-3 RNA-seq 結(jié)果的數(shù)據(jù)質(zhì)量Figure 1-3 Data quality of RNA-Seq. Replicate samples was clustered in the same groups, including thegroup of PC3_vector, PC3_shE2F1, DU145_vector, PC3_shE2F1 (A). The correlation analysis result wasthe same as the PCAresult (B).3.3 E2F1 敲低 CRPC 細(xì)胞的相關(guān)差異表達(dá)基因在我們的 RNA-seq 數(shù)據(jù)中，每種類(lèi)型的細(xì)胞總共有 26,354 個(gè)注釋的轉(zhuǎn)錄本。通過(guò)計(jì)算和分析 PC3_vector 與 PC3_shE2F1 之間各基因的差異表達(dá)（Differentiallyexpressedgenes,DEGs），鑒定出 1811 個(gè) DEGs，其中包括800 個(gè)上調(diào)基因和 1011 個(gè)下調(diào)基因（圖 1-4A 和表 S2）， PC3 細(xì)胞的 DEGs表達(dá)差異顯示于圖 4B 中。并且，DU145_vector 和 DU145_shE2F1 相比，有

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本文編號(hào)：2770301