發(fā)布時間：2020-07-25 20:07

【摘要】：第一章去勢抵抗性前列腺癌細胞中E2F1調(diào)控的重要基因和通路去勢抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer,CRPC)是前列腺癌治療的一個巨大挑戰(zhàn)。E2F轉(zhuǎn)錄因子1(E2F1)是CRPC中的一個重要因子,本研究的主要目的是發(fā)現(xiàn)E2F1通過調(diào)控哪些基因和通路來影響CRPC的細胞學(xué)行為。通過shRNA技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)敲低E2F1的CRPC細胞株P(guān)C3和DU145。采用流式細胞術(shù)、CCK8、transwell等方法檢測細胞(敲低E2F1的PC3和DU145)細胞學(xué)功能。用RNA-seq(RNA-sequencing)檢測敲低E2F1后細胞基因的表達水平,找到差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)。使用GeneMANIA數(shù)據(jù)庫進行基因共表達分析,GEPIA數(shù)據(jù)庫進行相關(guān)性分析。通過Metascape數(shù)據(jù)庫進行差異表達基因的通路富集。利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape軟件篩選Hub基因。通過實時定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和GEPIA等數(shù)據(jù)庫對DEGs表達水平進行驗證。敲低E2F1抑制PC3細胞的增殖并促進其凋亡,但對DU145細胞則無該影響。敲低E2F1均能降低PC3和DU145細胞的侵襲和遷移能力。敲低E2F1后,PC3細胞鑒定出了1811個DEGs,其中800個基因出現(xiàn)上調(diào),1011個基因出現(xiàn)下調(diào)。而敲低DU145細胞的E2F1后出現(xiàn)27個差異表達基因,包括6個基因上調(diào)和21個基因下調(diào)。獲得這兩個細胞的overlapped DEGs,包括CFH、IL1RL1、EVA1C、TMOD2、AIF1L、WIPF3、NXPH4、KREMEN2、PI3和E2F1�；蚬脖磉_分析顯示,KREMEN2和TMOD2分別與E2F1共表達,獨立于其他的overlapped DEG。相關(guān)分析說明CFH,IL1RL1,EVA1C,WIPF3,NXPH4,KREMEN2與E2F1正相關(guān)。PC3和DU145組的overlapped DEG僅富集在一個通路上:肌動蛋白絲組織通路(actin filament organization)。對PC3組進行模塊分析獲得總共有153個node和624個edge。篩選出10個hub DEGs,包括CCL2、FGF2、TLR2、CDH1、PTGS2、SHH、C3、VEGFA、PECAM1和CXCR4。此外,還找到了PC3中的一些其他重要的DEGs,包括NOTCH3、BID和STAT1。RT-qPCR驗證了兩株細胞的5個overlapped DEGs,PC3細胞的3個DEGs。EVA1C、IL1RL1和PTGS2可作為前列腺癌的潛在診斷標(biāo)志物。E2F1通過改變CRPC中一些基因如TMOD2的表達水平,在調(diào)節(jié)肌動蛋白絲組織通路中起著至關(guān)重要的作用,繼而改變CRPC細胞的細胞學(xué)功能。第二章E2F1的敲除對前列腺癌細胞功能的影響及前列腺癌中E2F1調(diào)控機制的研究通過前期構(gòu)建的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)E2F1可能受到多個上游基因的調(diào)控,也調(diào)控多個基因的表達。然而,E2F1在前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)細胞調(diào)控的基因并不明確,并且缺乏E2F1負調(diào)控下一基因的報道。因此,我們試圖找到敲除E2F1對PCa細胞學(xué)功能的影響以及E2F1在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上調(diào)控哪些重要的基因。通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建敲除E2F1的PC3細胞。采用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測E2F1在細胞中的敲除效果。流式細胞術(shù)、CCK8、transwell檢測細胞的凋亡、增殖、遷移和侵襲。并結(jié)合RNA-seq結(jié)果,分析前列腺癌細胞中E2F1的Ch IP-seq結(jié)果,找到受到E2F1正負調(diào)控的基因。RT-q PCR驗證這些基因。運用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建敲除E2F1的PC3細胞株。敲除E2F1后的PC3細胞增殖能力顯著降低(P0.01),對PC3細胞凋亡水平?jīng)]有顯著影響(P0.05),敲除E2F1后的PC3細胞侵襲能力顯著降低(P0.01),敲除E2F1后的PC3細胞遷移能力極顯著降低(P0.001)。上一章中10個overlapped基因,包括TMOD2,AIF1L,CFH,IL1RL1,EVA1C,WIPF3,NXPH4,KREMEN2和PI3均可以與E2F1結(jié)合。證實了E2F1可以通過調(diào)節(jié)TMOD2和AIF1L參與細胞肌動蛋白組織以調(diào)節(jié)細胞骨架。RT-q PCR驗證了PC3細胞中E2F1的敲除能夠顯著下調(diào)TMOD2和AIF1L,上調(diào)CFH,IL1RL1和EVA1C的表達。敲除E2F1后,CFH,IL1RL1和EVA1C表達水平升高,證明在PCa中確實存在可以被E2F1負調(diào)控的靶基因。一方面,證實了E2F1可以通過調(diào)節(jié)TMOD2和AIF1L參與調(diào)節(jié)細胞肌動蛋白以影響細胞骨架,繼而影響細胞學(xué)功能。另一方面,填補了E2F1負調(diào)控下一基因這一空白,完善了前列腺癌中E2F1的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。第三章基于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的前列腺癌細胞中多靶點聯(lián)合干擾的研究前列腺癌(Prostate Cancer)患者經(jīng)進一步去勢和/或抗雄激素藥物治療一段時間后,大部分發(fā)展成為去勢抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer,CRPC)。我們前期研究通過文本挖掘構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的負反饋環(huán)發(fā)現(xiàn),如果我們同時控制E2F1、MEK和NF-κB三個靶點,將有效地控制雄激素受體(Androgen Receptor,AR)的表達,這將為CRPC的治療提供有意義聯(lián)合治療靶點。通過sh RNA技術(shù)構(gòu)建敲低E2F1的穩(wěn)轉(zhuǎn)非雄激素依賴CRPC細胞株P(guān)C3、DU145和雄激素依賴PCa細胞株LNCa P。使用蛋白免疫印跡技術(shù)和免疫熒光技術(shù)分別檢測抑制劑對MEK和NF-κB的抑制效果。通過流式細胞術(shù)、CCK-8、transwell檢測E2F1、MEK和NF-κB三個靶點的聯(lián)合干擾對三株細胞凋亡、增殖、遷移和侵襲方面的影響。熒光定量PCR技術(shù)(RTq PCR)檢測三個靶點的聯(lián)合干擾對腫瘤行為相關(guān)基因(MMP2、VEGFA、CDH1、BCL-2)表達的影響。由RNA-sequencing(RNA-seq)結(jié)果分析CRPC細胞的差異表達基因(Different expression genes,DEGs),通過DEGs的通路富集分析以找到聯(lián)合干擾三個靶點后哪些重要的通路等發(fā)生了變化。通過PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析找到主要發(fā)生改變的模塊。通過hub基因(hub gene)的獲得以了解聯(lián)合干擾后什哪些關(guān)鍵基因發(fā)生了改變。20μM PD0325901和5μM SC75741作用48h,可以對敲低E2F1的CRPC細胞的MEK和NF-κB產(chǎn)生良好的抑制效果。對三個靶點進行聯(lián)合干擾后,PC3、DU145和LNCa P三株細胞的增殖能力極顯著降低(P0.001),且低于加入CRPC治療的臨床藥物阿比特龍的陽性對照組。聯(lián)合干擾后,PC3(P0.001)和DU145(P0.05)細胞的侵襲能力下降,且低于陽性對照組。聯(lián)合干擾可以使PC3(P0.001)、DU145(P0.05)和LNCa P(P0.001)細胞的遷移能力下降,且低于陽性對照組;聯(lián)合干擾三株細胞,顯著增強細胞的凋亡(P0.001),且高于陽性對照組。聯(lián)合干擾后,PC3細胞的MMP2基因表達水平極顯著表達上調(diào)(P0.001),DU145細胞的MMP2基因則出現(xiàn)了極顯著下調(diào)的情況(P0.001)。聯(lián)合干擾后VEGFA、BCL-2、CDH1三個基因表達水平,在PC3、DU145細胞中均出現(xiàn)顯著或極顯著下調(diào)(P0.01或P0.001),且表達水平均低于陽性對照組。聯(lián)合干擾后PC3細胞出現(xiàn)的745個DEGs,其中316個基因上調(diào),429個基因下調(diào)。DEGs富集在包括細胞因子介導(dǎo)的信號通路、病毒防御反應(yīng)通路、前期染色體的凝結(jié)通路、趨化性通路和細胞分裂通路等重要的通路上。發(fā)差異表達基因?qū)毎挠绊懼饕?個主要的簇狀通路:影響染色體的通路,關(guān)于趨化性的通路、關(guān)于干擾素的通路以及關(guān)于細胞行為的通路等。找到包括IL6、BIRC5、CDH1、PLK1、CDK1、CDC20等基因在內(nèi)的20個hub基因。與正常組織相比,BIRC5、CCNB1、CDC20、CDH1、TOP2A和UBE2C基因在前列腺癌組織中出現(xiàn)了差異表達的情況,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。BIRC5、CCNA2、KIF2C、PLK1和CDC20與前列腺癌患者的總生存率相關(guān),具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(8)BIRC5和CDC20在差異表達和生存分析中均有顯著差異,有望成為前列腺癌診斷、預(yù)后的新指標(biāo)。E2F1、MEK和NF-κB三個靶點的聯(lián)合干擾抑制CRPC細胞PC3、DU145,甚至是雄激素依賴細胞LNCa P的增殖、侵襲和遷移,促進他們的凋亡,顯著下調(diào)多個腫瘤行為相關(guān)基因,這將為CRPC的治療提供有意義聯(lián)合治療靶點。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.25
【圖文】：

在兩種細胞系中， E2F1 表達確實已經(jīng)被抑制，敲低 E2F1 的 CRPC 細胞株已經(jīng)成功構(gòu)建。（P < 0.001，圖1-1C，D）。圖 1-1 構(gòu)建敲低 E2F1 的 PC3 和 DU145 細胞Figure 1-1 The construction of PC3 and DU145 cells by the downregulating of E2F1 expression.The phenotypic characterization of PC3 (A) and DU145 (B) groups; ‘vector’, empty vector as negativecontrol; ‘shE2F1’, shRNAfor E2F1. The expression of the E2F1 was suppressed by shE2F1 in PC3(C) andDU145 (D). Statistical significance was calculated using an independent-sample t-test. *p<0.05, **p<0.01.為了研究 E2F1 對 CRPC 細胞功能的影響，我們檢測了敲低 E2F1 后DU145 和 PC3 細胞的凋亡、增殖、遷移和侵襲。如圖 1-2A 所示，對于PC3_vector、PC3_shE2F1 細胞，早期細胞凋亡從 1.4％增加至 22.3％，而晚期細胞凋亡從 0.5％增加至 4.6％，最顯著的變化發(fā)生在早期凋亡階段（P <0.001）。與之相比，在 DU145 細胞中

圖 1-2 構(gòu)建敲低 E2F1 的 PC3 和 DU145 細胞的細胞功能學(xué)實驗Figure 1-2 The cellular function of PC3 and DU145 cells with knock-down of E2F1Flow cytometry study of PC3 and DU145 groups stained withAnnexin VAPC/7-AAD (A). PC3 (B) andDU145 (C) proliferation level detected by CCK-8 kit. PC3 cell migration (D) and invasion (E) and DU145cell migration (F) and invasion (G) were detected using transwell assays. Statistical significance wascalculated using an independent-sample t-test. *P<0.05, **P<0.01.3.2 E2F1 基因敲低后 RNA 測序數(shù)據(jù)的基本情況為了研究在 CRPC 中 E2F1 的分子調(diào)控機制，使用 RNA-seq 分析了敲低 E2F1 后 PC3 和 DU145 細胞及其對照的轉(zhuǎn)錄譜。共有 12 個測序樣本，每組有 3 個重復(fù)。每組樣本（包括 PC3_vector、DU145_vector、PC3_shE2F1和 DU145_shE2F1 組）的重復(fù)的 致性良好（圖 1-3A、1-3B）。

圖 1-3 RNA-seq 結(jié)果的數(shù)據(jù)質(zhì)量Figure 1-3 Data quality of RNA-Seq. Replicate samples was clustered in the same groups, including thegroup of PC3_vector, PC3_shE2F1, DU145_vector, PC3_shE2F1 (A). The correlation analysis result wasthe same as the PCAresult (B).3.3 E2F1 敲低 CRPC 細胞的相關(guān)差異表達基因在我們的 RNA-seq 數(shù)據(jù)中，每種類型的細胞總共有 26,354 個注釋的轉(zhuǎn)錄本。通過計算和分析 PC3_vector 與 PC3_shE2F1 之間各基因的差異表達（Differentiallyexpressedgenes,DEGs），鑒定出 1811 個 DEGs，其中包括800 個上調(diào)基因和 1011 個下調(diào)基因（圖 1-4A 和表 S2）， PC3 細胞的 DEGs表達差異顯示于圖 4B 中。并且，DU145_vector 和 DU145_shE2F1 相比，有

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1 馬建宏;曹開源;徐霖;鐘慧玲;張素粉;羅虹嬌;庹玖玲;張?zhí)?劉建中;;前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2015年11期

2 姚

本文編號：2770301