【摘要】：目的:探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(human umbilical cord mesenchymal stem cell exosome,hucMSC-Ex)是否能緩解草酸和一水草酸鈣(calcium oxalate monohydrate,COM)晶體誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)氧化應(yīng)激及纖維化及其機(jī)制。方法:(1)采用草酸和COM晶體誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞。(2)采用無(wú)外泌體胎牛血清培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,差速離心法提取其外泌體。Western blot檢測(cè)其表面標(biāo)志蛋TSG101,CD63,Alix表達(dá),透射電鏡檢測(cè)其形態(tài),NTA檢測(cè)hucMSC-Ex粒徑。PKH-26標(biāo)記外泌體與細(xì)胞共培養(yǎng),觀察其細(xì)胞內(nèi)定位。(3)將HK-2細(xì)胞分為4組,對(duì)照組;外泌體組;草酸+COM組;草酸+COM+外泌體組。將外泌體加入培養(yǎng)基中6h后加入草酸及COM晶體懸濁液培養(yǎng)液。(4)MTT法于24h、48h和72h檢測(cè)各組細(xì)胞活性,采用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞LDH、H_2O_2、MDA及ROS水平,免疫熒光檢測(cè)ZO-1、N-Cadherin、TGF-β蛋白的表達(dá);Western blot檢測(cè)上皮標(biāo)志物E-Cadherin,ZO-1,間質(zhì)標(biāo)志物N-Cadherin,α-SMA及相關(guān)信號(hào)通路蛋白TGF-β、Smad2的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)草酸和COM晶體處理48h后,HK-2細(xì)胞活性降低,形態(tài)發(fā)生纖維化改變,細(xì)胞形態(tài)呈多角形、長(zhǎng)梭形,細(xì)胞間隙增加,粘附性降低。草酸和COM晶體可降低HK-2細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin、ZO-1表達(dá),同時(shí)使HK-2細(xì)胞高表達(dá)間質(zhì)標(biāo)志物N-Cadherin、α-SMA并上調(diào)信號(hào)通路蛋白TGF-β、Smad2表達(dá)(2)WB結(jié)果顯示提取出的hucMSC-Ex陽(yáng)性表達(dá)TSG101,CD63,Alix;電鏡下可觀察到其形態(tài)呈雙層膜,中空,圓形或橢圓形。NTA結(jié)果顯示其大小分布在50~300nm。PKH26標(biāo)記后的hucMSC-Ex與細(xì)胞共培養(yǎng)6h后進(jìn)入細(xì)胞。(3)MTT結(jié)果顯示:hucMSC-Ex預(yù)處理可顯著提高暴露于草酸及COM晶體的HK-2細(xì)胞活性。外泌體干預(yù)后,HK-2細(xì)胞LDH、H_2O_2、MDA及ROS水平較誘導(dǎo)后下降。熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)hucMSC-Ex可升高草酸和COM晶體干預(yù)后細(xì)胞上皮標(biāo)志物ZO-1表達(dá),降低N-Cadherin、TGF-β蛋白表達(dá);光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與外泌體組細(xì)胞連接緊密,呈鋪路石樣,草酸及COM晶體干預(yù)后HK-2細(xì)胞間隙增加,粘附性降低,呈多角形、長(zhǎng)梭形,細(xì)胞數(shù)明顯少于其他組,同一時(shí)間點(diǎn)hucMSC-Ex干預(yù)后細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常減少。WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)hucMSC-Ex可升高草酸及COM晶體干預(yù)后HK-2細(xì)胞上皮標(biāo)志物ZO-1、E-Cadherin表達(dá),降低間質(zhì)標(biāo)志物N-Cadherin、α-SMA蛋白表達(dá),TGF-β、Smad2蛋白表達(dá)趨勢(shì)與N-Cadherin、α-SMA相同。結(jié)論:(1)超速離心法可成功提取到hucMSC外泌體(2)草酸及COM晶體可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(3)hucMSC-Ex能提高草酸及COM晶體誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活性,減輕其氧化應(yīng)激損傷,同時(shí)緩解其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R691.4
【圖文】：

圖 1 hucMSC-Ex 分離流程示意圖Fig1 The schematic of the hucMSC-Ex isolation protocol觀察 hucMSC-Ex 形態(tài)體懸液 10μl，20 倍體積 1x PBS 稀釋，吹打混勻；0μl 滴加于 2nm 電鏡銅網(wǎng)狀柵中；夜干燥，醋酸雙氧鈾負(fù)染 30s，吸走銅網(wǎng)周邊多余液體鏡 80kV 拍照并保存圖像。lot 檢測(cè) hucMSC-Ex 蛋白標(biāo)志物μl 外泌體懸液加入 PMSF 1μl 及 100μl 蛋白裂解液 RIPA液在 4℃超聲裂解 15min, 12,000 g 離心 10 min , 取上清明書，用 BCA 法測(cè)定蛋白濃度，；

顯影后保存圖像。TA 鑒定 hucMSC-Ex 粒徑大小及分布 取用 PBS 重懸的外泌體懸液 0.1ml； 在 4℃條件下用 PBS 稀釋 10 倍后加入比色皿中； 放入馬爾文 Zs90 粒度電位儀樣品池中測(cè)量其粒徑大小。果ucMSCs 鏡下形態(tài)用 10% exo-free FBS DMEM/F12 培養(yǎng)的 hucMSC, 貼壁后鏡下形態(tài)良好,呈較均一的長(zhǎng)梭形, 類似成纖維細(xì)胞, 呈漩渦狀生長(zhǎng), 胞漿豐富, 細(xì)胞核 2）。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文取的 hucMSC-Ex 懸液用 20 倍體積 1×PBS 稀釋后, 于透射電鏡下可分布圓形或橢圓形的膜性小囊泡, 具有較明顯異質(zhì)性, 直徑介于 3外周可見其膜性結(jié)構(gòu), 內(nèi)含低密度物質(zhì)（圖 3）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 章俊;邱敏姿;馬亞瓊;卜陽(yáng);楊蕾;湯s

本文編號(hào)：2769533