【摘要】：前列腺癌和膀胱癌分別是西方國(guó)家及我國(guó)發(fā)病率最高的泌尿系統(tǒng)腫瘤。盡管其在我國(guó)的發(fā)病率較常見的呼吸系統(tǒng),消化系統(tǒng)惡性腫瘤略低,但隨著社會(huì)老齡化趨勢(shì)日益顯現(xiàn),前列腺癌及膀胱癌的發(fā)病率出現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì),其在惡性腫瘤研究中的重要性也越來(lái)越明顯。雖然目前超聲及CT等診斷技術(shù)的不斷發(fā)展和普及大大提高了前列腺癌和膀胱癌的早期檢出率,但仍有絕大部分患者在腫瘤晚期才因出現(xiàn)癥狀而就診,導(dǎo)致治療時(shí)機(jī)的延誤。由于前列腺癌的發(fā)病率在西方人群所有腫瘤中位于首位,在腫瘤相關(guān)的死亡中位列第二,因而在西方國(guó)家關(guān)于前列腺癌的研究也始終是眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。盡管我國(guó)尚屬于前列腺癌發(fā)病率相對(duì)較低的地區(qū),但由于近年來(lái)前列腺癌的發(fā)病率增速逐漸加快,使得國(guó)內(nèi)關(guān)于前列腺癌發(fā)病機(jī)制的研究也逐漸升溫。而關(guān)于在我國(guó)泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率最高的膀胱癌,其具有明顯的高復(fù)發(fā)性,目前臨床上尚無(wú)有效的治療手段,且傳統(tǒng)的病理分級(jí)分期方法在膀胱癌的生物行為預(yù)測(cè)方面作用有限。故深入研究前列腺癌和膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)改變,將極大地有利于疾病的早期診斷及臨床治療,在推動(dòng)科學(xué)研究和臨床進(jìn)展方面,均具有十分重要而積極的意義。與其他惡性腫瘤一樣,前列腺癌和膀胱癌的的發(fā)生也是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。既往研究已發(fā)現(xiàn)一系列基因的變異及其引起的功能異常及相應(yīng)的細(xì)胞生物學(xué)行為紊亂與前列腺癌和膀胱癌的發(fā)生有關(guān)。然而,隨著腫瘤分子遺傳機(jī)制的研究深入,人們逐漸發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)機(jī)制,在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中同樣發(fā)揮著舉足輕重的作用。目前研究較為廣泛的表觀遺傳學(xué)機(jī)制主要包括染色質(zhì)重塑,組蛋白修飾,DNA甲基化和調(diào)控型(非編碼)RNA等。LncRNA,又稱長(zhǎng)鏈非編碼RNA,是一類長(zhǎng)度超過(guò)200nt,不具有蛋白編碼功能的RNA。眾多研究表明,lncRNA作為一種重要的表觀遺傳學(xué)形式,在細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)層面上發(fā)揮作用。此外lncRNA具有不同位置特點(diǎn),導(dǎo)致其可能通過(guò)迥異的機(jī)制發(fā)揮其基因調(diào)控作用。隨著基因組中l(wèi)ncRNA的不斷發(fā)現(xiàn),其在惡性腫瘤中的作用也受到研究者們?cè)絹?lái)越廣泛的關(guān)注。在一些常見腫瘤,如肺癌,肝癌及乳腺癌等的研究中,都發(fā)現(xiàn)了特定lncRNA的異常表達(dá),而這種異常往往提示lncRNA與腫瘤發(fā)生的生物學(xué)過(guò)程相關(guān)。而關(guān)于lncRNA具體作用機(jī)制的研究目前尚處于起步階段,對(duì)于其在前列腺癌和膀胱癌中的作用,仍有待進(jìn)一步闡釋。本研究擬分別采用文獻(xiàn)篩選和芯片篩選的策略,尋找在前列腺癌和膀胱癌中差異表達(dá)的lncRNA,并通過(guò)一系列分子生物學(xué)手段,闡明其在惡性腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用及可能的分子機(jī)制,為進(jìn)一步揭示lncRNA在前列腺癌及膀胱癌發(fā)病機(jī)制中的作用提供了理論依據(jù),并為今后泌尿系統(tǒng)腫瘤的個(gè)體化預(yù)防,早期干預(yù)及診斷等提供重要參考。第一部分LncRNA intronic-ABCAl參與前列腺癌發(fā)病機(jī)制的初步探討研究背景：前列腺癌是在西方發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率最高的惡性腫瘤。ABCAl是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有重要功能的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)大分子膜蛋白,它的主要生物學(xué)功能是膽固醇從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外,并將其包裝成為高密度脂蛋白,并通過(guò)此機(jī)制參與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。而在該基因區(qū)域存在的內(nèi)含子區(qū)lncRNA則可能通過(guò)調(diào)控該基因表達(dá),進(jìn)而影響前列腺癌的發(fā)病過(guò)程。方法及結(jié)果：生物信息學(xué)查詢也發(fā)現(xiàn)ABCAl所在區(qū)域存在一個(gè)內(nèi)含子區(qū)lncRNA,本研究中將其命名為intronic-ABCAl。在前列腺癌及癌旁組織中進(jìn)行RT-PCR表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),lncRNA intronic-ABCA1在前列腺癌組織中表達(dá)水平下降,而ABCA1 mRNA表達(dá)水平上升。構(gòu)建intronic-ABCA1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)前列腺癌細(xì)胞株中,發(fā)現(xiàn)其相鄰編碼基因ABCA1的表達(dá)水平被顯著抑制,通過(guò)RT-PCR方法及Western blot方法分別在RNA水平和蛋白水平證實(shí)了該抑制效應(yīng)。我們進(jìn)而通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)觀察了intronic-ABCA1過(guò)表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響,發(fā)現(xiàn)了其具有抑制細(xì)胞增殖及遷移能力的作用,并且這種作用可能與其對(duì)ABCA1表達(dá)量的調(diào)控有關(guān)。結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA intronic-ABCA1在前列腺癌組織中表達(dá)下調(diào),其對(duì)ABCA1基因表達(dá)具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用,且可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖及遷移能力。第二部分LncRNA MDC1-AS對(duì)膀胱癌的抑制作用及其分子機(jī)制研究研究背景：膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,且具有明顯的高復(fù)發(fā)性。反義lncRNA通過(guò)多種機(jī)制參與生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。MDC1是細(xì)胞內(nèi)DNA損傷應(yīng)答過(guò)程中的重要分子,并且在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。方法及結(jié)果：我們對(duì)3對(duì)膀胱癌及癌旁組織進(jìn)行了lncRNA表達(dá)譜芯片篩查,發(fā)現(xiàn)DNA修復(fù)基因MDC1的反義lncRNA在膀胱癌組織中顯著低表達(dá),本研究中將其命名為MDCl-AS。在隨后擴(kuò)大樣本量的RT-PCR驗(yàn)證中,也證實(shí)了MDC1-AS在膀胱癌組織中顯著下調(diào),且其相鄰編碼基因MDC1在膀胱癌組織中也呈現(xiàn)低表達(dá)趨勢(shì),相關(guān)性分析表明二者的表達(dá)水平呈顯著的正相關(guān)性。我們構(gòu)建了MDC1-AS的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)染進(jìn)膀胱癌細(xì)胞株EJ和T24中,發(fā)現(xiàn),MDC1-AS對(duì)MDCl基因的mRNA水平及蛋白水平均有明顯的上調(diào)作用。我們進(jìn)而通過(guò)一系列細(xì)胞惡性表型實(shí)驗(yàn),包括CCK-8, Transwell,平板克隆及流式細(xì)胞檢測(cè)等方法,觀察了MDC1-AS對(duì)多種細(xì)胞惡性表型的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDC1-AS具有顯著抑制膀胱癌細(xì)胞增殖,遷移及克隆形成的作用。最后,為探討MDC1-AS對(duì)細(xì)胞表型的影響是否與其對(duì)MDC1的表達(dá)調(diào)控作用有關(guān),我們采用siRNA的方法,干擾MDC1基因的表達(dá),并且發(fā)現(xiàn)MDC1-AS對(duì)細(xì)胞惡性表型的抑制作用明顯減弱,由此可推斷MDC1-AS對(duì)細(xì)胞惡性表型的抑制作用是通過(guò)其對(duì)MDCl基因的正向調(diào)控作用實(shí)現(xiàn)的。結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)lncRNAMDCl-AS具有顯著的低表達(dá)趨勢(shì),且對(duì)其相鄰編碼基因MDC1的表達(dá)具有正向調(diào)節(jié)作用。MDC1-AS具有抑制膀胱癌細(xì)胞增殖,遷移及克隆形成的能力,并且這種抑制作用與其對(duì)MDC1的調(diào)控作用相關(guān)。本研究結(jié)果不僅闡釋了lncRNA在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,同時(shí)也為臨床上尋找疾病新的生物標(biāo)志物提供了線索,為深入理解lncRNA在惡性腫瘤中的作用及其機(jī)制提供了依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.25;R737.14
【圖文】：

不同的剪切方式，（２）多數(shù)ＩｎｃＲＮＡ的表達(dá)都具有時(shí)空特異巧Ｐｓｉ，（３）眾多逡逑ＩｎｃＲＮＡ在疾病中呈現(xiàn)異常的表達(dá)方式ＰＷ。現(xiàn)有的研巧表明，ＩｎｃＲＮＡ作為一種逡逑重要的表觀遺傳學(xué)形式，在細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)層面上發(fā)揮著調(diào)控作用（見圖１）。如，逡逑干擾鄰近的編碼基因表達(dá)；介導(dǎo)染色質(zhì)重塑和組蛋白修飾；與編碼蛋白基因的逡逑轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，干擾ｍＲＮＡ剪切；與特定蛋白質(zhì)結(jié)合改變蛋白質(zhì)胞內(nèi)定逡逑位等ＰＳ１。依據(jù)ＩｎｃＲＮＡ基因位置，可將其大致分為五類；１．同義；２．反義ＩｎｃＲＮＡ，逡逑即ＩｎｃＲＮＡ基因與同一鏈上的編碼基因外顯子全部或部分重疊，且其轉(zhuǎn)錄方向逡逑相同（同義）或相反（反義）；３．雙向ＩｎｃＲＮＡ，指ＩｎｃＲＮＡ基因可從與其相鄰逡逑的編碼基因相同或相反兩個(gè)方向轉(zhuǎn)錄；４．內(nèi)含子ＩｎｃＲＮＡ，指ＩｎｃＲＮＡ完全轉(zhuǎn)錄逡逑１３逡逑

圖１－１．邋ＲＴ－ＰＣＲ循環(huán)參數(shù)設(shè)置逡逑測(cè)得ｉｎｔｒｏｎｉｃ－ＡＢＣＡｌ及ＡＢＣＡ１邋相對(duì)表達(dá)量｜＾ｊｌ邋２－＆曰了計(jì)算，ＡＣｔ邋＝邋Ｃｔ邋（目的）－Ｃｔ邋（內(nèi)逡逑參）0逡逑

邐南京醫(yī)科大學(xué)博±學(xué)位論文逡逑結(jié)果逡逑１．生物信息學(xué)網(wǎng)站查詢結(jié)果逡逑通過(guò)數(shù)據(jù)查詢，我們發(fā)現(xiàn)在編碼基因＾公Ｇ４／附近，存在一個(gè)內(nèi)含子區(qū)逡逑ＩｎｃＲＮＡ。該轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度為４６９ｂｐ，編號(hào)ＥＮＳＴ０００００４３５９１５，來(lái)自于９號(hào)染色體逡逑與＾公（心；基因內(nèi)含子區(qū)轉(zhuǎn)錄本相反的ＤＮＡ鏈上。因此，我們將其命名為逡逑ｉｎｔｒｏｎｉｃ－ＡＢＣＡｌ邋0逡逑在生物信息學(xué)網(wǎng)站Ｃｏｄｉｎｇ邋Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邋Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ邋Ｔｏｏｌ邋（ＣＰＡＴ）上預(yù)測(cè)該逡逑ＩｎｃＲＮＡ序列的蛋白編碼能力。如圖１－２所示，該段序列并不具備蛋白編碼的能逡逑力（ｃｏｄｉｎｇ邋ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ邋為邋０．０２６）。因此可確認(rèn)邋ｉｎｔｒｏｎｉｃ－ＡＢＣＡｌ邋為NBＳＣ４／邋基因的逡逑內(nèi)含子區(qū)ＩｎｃＲＮＡ。逡逑Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ邋Ｕｓｅｒ邋Ｇｕｉｄｅ邋Ｆｅｅｄｂａｃｋ邋Ｓｏｕｒｃｅ邋Ｃｏｄｅ逡逑

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本文編號(hào)：2769451