【摘要】：研究背景膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率在我國(guó)男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中均居首位,嚴(yán)重威脅人類健康。臨床上,膀胱癌可分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(pTis、pTa、pT1)和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(pT2-pT4),二者的生物學(xué)特性及采用的治療方案顯著不同。非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌又稱為表淺性膀胱癌,首選經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)(TUR-BT)進(jìn)行微創(chuàng)治療,預(yù)后相對(duì)較好;而肌層浸潤(rùn)性膀胱癌惡性程度高,發(fā)生轉(zhuǎn)移早,預(yù)后較差,5年生存率僅為50-60%,其標(biāo)準(zhǔn)治療方案則是采用根治性膀胱切除術(shù)同時(shí)行盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)。膀胱癌患者初診時(shí)30%已發(fā)生肌層浸潤(rùn),而在非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者中,仍有30%會(huì)復(fù)發(fā)為浸潤(rùn)性膀胱癌。對(duì)膀胱癌進(jìn)行早期診斷并對(duì)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌進(jìn)行術(shù)前有效鑒別是膀胱癌治療方案選擇的關(guān)鍵。目前臨床上診斷膀胱癌主要依賴于膀胱鏡、尿脫落細(xì)胞學(xué)和影像學(xué)檢查等。膀胱鏡是膀胱癌診斷的常用方法,可造成不同程度的尿道和膀胱損傷以及感染等并發(fā)癥;尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查具有非侵入性、特異性高等優(yōu)點(diǎn),但其敏感性低于50%,對(duì)早期患者僅為30%,易受檢測(cè)者主觀因素的影響;CT和超聲檢查是目前診斷膀胱癌及術(shù)前分期最常用的影像學(xué)檢查方法,但不易發(fā)現(xiàn)膀胱內(nèi)微小病變,使其對(duì)膀胱癌分期預(yù)測(cè)的價(jià)值受到一定限制;TUR-BT主要用于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的治療,同時(shí)也可為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌提供分期依據(jù),但由于手術(shù)本身的風(fēng)險(xiǎn)及依從性差限制了其在膀胱癌分期預(yù)測(cè)上的廣泛應(yīng)用。尋找敏感性、特異性高的新型生物標(biāo)志物用于膀胱癌早期發(fā)現(xiàn)并對(duì)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌進(jìn)行術(shù)前預(yù)測(cè)仍是目前關(guān)注的焦點(diǎn)。MicroRNAs (miRNAs)通過(guò)與靶mRNA分子完全或不完全配對(duì)結(jié)合從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá),在腫瘤發(fā)生發(fā)展調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中扮演著至關(guān)重要的角色。對(duì)不同類型腫瘤中的miRNAs分析發(fā)現(xiàn),miRNAs表達(dá)譜具有明顯的腫瘤特異性,并且在腫瘤的不同分期中其也具有特定的表達(dá)模式,提示其可作為腫瘤診斷及分期預(yù)測(cè)的潛在標(biāo)志物。近年研究表明,尿液上清中存在豐富且穩(wěn)定的miRNAs,其與泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),為腫瘤的無(wú)創(chuàng)診斷提供了新思路。篩選鑒定尿液游離miRNAs表達(dá)譜并引入構(gòu)建模型從而用于膀胱癌的無(wú)創(chuàng)性診斷和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的預(yù)測(cè),將有助于膀胱癌的早期發(fā)現(xiàn)及臨床治療方案的選擇。RT-qPCR是目前miRNAs定量檢測(cè)最常用的技術(shù)手段,其檢測(cè)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化主要選用內(nèi)參基因進(jìn)行校正。采用一種最適的內(nèi)參基因來(lái)對(duì)miRNAs的表達(dá)量進(jìn)行校正可以提高RT-qPCR檢測(cè)的重復(fù)性和靈敏度。對(duì)于膀胱癌尿液游離miRNAs RT-qPCR定量檢測(cè),目前尚無(wú)最適內(nèi)參基因系統(tǒng)篩選的相關(guān)研究。鑒于此,本課題首先采用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合RT-qPCR技術(shù)系統(tǒng)篩選并確定可用于尿液游離miRNAs定量檢測(cè)的最適內(nèi)參基因;以篩選的最適內(nèi)參基因?yàn)閰⒄?進(jìn)一步篩選膀胱癌特異尿液游離miRNAs差異表達(dá)譜,結(jié)合logistic回歸分析構(gòu)建膀胱癌診斷模型并評(píng)價(jià)其在膀胱癌早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值;同時(shí),采用上述技術(shù)手段系統(tǒng)篩選對(duì)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌有預(yù)測(cè)價(jià)值的尿液miRNAs差異表達(dá)譜,結(jié)合logistic回歸分析構(gòu)建膀胱癌分期預(yù)測(cè)模型并評(píng)價(jià)其在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌預(yù)測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值;最后通過(guò)膀胱癌組織樣本檢測(cè)及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),研究相關(guān)miRNAs分子在膀胱癌中的生物學(xué)功能。本研究將建立基于尿液游離miRNAs新型生物標(biāo)志物的膀胱癌診斷和分期預(yù)測(cè)模型,為膀胱癌的無(wú)創(chuàng)診斷及分期預(yù)測(cè)開(kāi)辟新途徑,并為膀胱癌的有效治療提供新靶點(diǎn)。第一部分膀胱癌尿液microRNAs RT-qPCR檢測(cè)最適內(nèi)參基因的選擇與驗(yàn)證研究目的實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)是目前尿液游離microRNAs (miRNAs)檢測(cè)最常用的方法,選擇合適的內(nèi)參基因進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化是獲得可信RT-qPCR定量數(shù)據(jù)的重要保證。本研究旨在對(duì)膀胱癌尿液游離miRNAs RT-qPCR檢測(cè)的內(nèi)參基因進(jìn)行系統(tǒng)篩選和驗(yàn)證,確定可用于膀胱癌尿液游離miRNAs RT-qPCR檢測(cè)的最適內(nèi)參基因。方法1.收集6例膀胱癌和6例健康對(duì)照尿液上清,采用Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)兩組樣本進(jìn)行分析,選擇拷貝數(shù)大于50,在兩組樣本中表達(dá)無(wú)差異且在兩組之間倍數(shù)小于1.2的miRNAs分子作為候選的內(nèi)參基因。2.采用RT-qPCR技術(shù)在80例膀胱癌和80例健康對(duì)照尿液上清中對(duì)測(cè)序篩選出的候選內(nèi)參基因和目前常用內(nèi)參基因U6 snRNA進(jìn)行初步驗(yàn)證。3.利用NormFinder和geNorm軟件評(píng)估內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性,確定最適的內(nèi)參基因。4.采用RT-qPCR技術(shù)在63例膀胱癌和63例健康對(duì)照尿液上清中對(duì)篩選確定的最適內(nèi)參基因進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果1.候選內(nèi)參基因的測(cè)序篩選:膀胱癌組和健康對(duì)照者組比較發(fā)現(xiàn),根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn),拷貝數(shù)大于50,兩組間表達(dá)無(wú)差異且兩組倍數(shù)小于1.2的miRNAs分子為 13 個(gè)(let-7b-5p、miR-532-5p、miR-23b-5p、miR-100-5p、miR-20a-5p、miR-28-3p、miR-34a-5p、miR-17-5p、miR-133a-3p、miR-194-5p、miR-30b-5p、miR-98-5p 和miR-99b-5p),同時(shí)也將U6 snRNA作為候選內(nèi)參基因納入進(jìn)行下一步驗(yàn)證。2.候選內(nèi)參基因的RT-qPCR驗(yàn)證:在上述14個(gè)候選的內(nèi)參基因中,有4個(gè) miRNAs 分子(miR-17-5p、miR-133a-3p、miR-30b-5p和miR-98-5p)在尿液上清標(biāo)本中無(wú)法檢測(cè)到;2個(gè)miRNAs分子(miR-194-5p和miR-99b-5p)的RT-qPCR 檢測(cè)的平均 Cq 值大于 35; 7 個(gè) miRNAs (miR-100-5p、miR-20a-5p、miR-23b-5p、miR-28-3p、miR-34a-5p、miR-532-5p 和 let-7b-5p)和 U6 snRNA在所有尿液上清樣本中均可檢測(cè)到且Cq均值小于35。3.確定的內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)估:利用NormFinder和geNorm兩個(gè)軟件評(píng)估上述7個(gè)確定的miRNAs分子和U6 snRNA的穩(wěn)定性,兩個(gè)軟件均顯示let-7b-5p是表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因,let-7b-5p和miR-532-5p組合是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合。4.最適內(nèi)參基因的驗(yàn)證:運(yùn)用另外一組獨(dú)立的樣本(63例膀胱癌和63例健康對(duì)照尿液上清標(biāo)本)進(jìn)行最適內(nèi)參基因的驗(yàn)證,結(jié)果顯示let-7b-5p、miR-532-5p及l(fā)et-7b-5p和miR-532-5p組合在膀胱癌組和健康對(duì)照組兩組間表達(dá)均無(wú)差異(均P0.05),在不同分期的膀胱癌患者中表達(dá)也無(wú)差異(均P0.05)。結(jié)論let-7b-5p和miR-532-5p組合可作為膀胱癌和健康對(duì)照尿液游離miRNAs RT-qPCR檢測(cè)的最適內(nèi)參基因。第二部分基于尿液microRNAs表達(dá)譜的膀胱癌診斷模型的構(gòu)建及臨床應(yīng)用研究目的膀胱癌在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率均占男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的首位,且呈逐年上升趨勢(shì)。目前臨床上診斷膀胱癌的主要技術(shù)手段仍依賴于膀胱鏡、尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)和影像學(xué)檢查等,它們雖各有優(yōu)勢(shì),但或具侵入性,或依從性差,或敏感性和特異性不足,尚無(wú)法滿足臨床需求。研究發(fā)現(xiàn),尿液上清中存在豐富而穩(wěn)定的游離microRNAs (miRNAs),其與泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),為腫瘤的無(wú)創(chuàng)性診斷開(kāi)辟了一條新的途徑。本研究旨在系統(tǒng)篩選膀胱癌特異尿液游離miRNAs表達(dá)譜,進(jìn)一步運(yùn)用logistic回歸分析構(gòu)建基于尿液游離miRNAs的膀胱癌診斷模型用于膀胱癌的診斷。方法1.收集6例膀胱癌和6例健康對(duì)照尿液上清,采用Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)兩組樣本進(jìn)行分析,選擇在兩組樣本中表達(dá)呈顯著差異且兩組之間倍數(shù)大于2的miRNAs作為候選miRNAs分子。2.采用RT-qPCR技術(shù)在150例膀胱癌和150例健康對(duì)照尿液上清中對(duì)上一步測(cè)序篩選出的候選miRNAs分子進(jìn)行驗(yàn)證。并采用受試者工作曲線(ROC)評(píng)估驗(yàn)證后的呈差異表達(dá)的miRNAs分子對(duì)膀胱癌的診斷效能。3.通過(guò)logistic回歸分析將驗(yàn)證出的對(duì)膀胱癌具有診斷價(jià)值的miRNAs分子構(gòu)建膀胱癌診斷模型。4.采用RT-qPCR技術(shù)在另外一組獨(dú)立樣本(120例膀胱癌和120例健康對(duì)照)尿液上清中對(duì)膀胱癌診斷模型進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)檢測(cè)上述240例受試者的尿液脫落細(xì)胞學(xué),并比較尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)和診斷模型對(duì)膀胱癌的早期診斷價(jià)值。5.采用Mann-Whitney U或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析上述具有診斷價(jià)值的miRNAs分子的表達(dá)與膀胱癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。6.采用單因素Kaplan-Meier分析方法,對(duì)膀胱癌患者的復(fù)發(fā)情況進(jìn)行分析,并用log-rank test統(tǒng)計(jì)比較上述miRNAs分子與膀胱癌復(fù)發(fā)的關(guān)系。進(jìn)一步采用單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型評(píng)估m(xù)iRNAs分子在膀胱癌復(fù)發(fā)中的預(yù)測(cè)價(jià)值。結(jié)果1.差異miRNAs測(cè)序篩選:高通量測(cè)序結(jié)果顯示,膀胱癌和健康對(duì)照尿液上清中拷貝數(shù)大于50的miRNAs分子分別為256和308個(gè)。在兩組間表達(dá)呈顯著差異且倍數(shù)大于2的miRNAs分子為23個(gè),其中在膀胱癌組中呈高表達(dá)的為16 個(gè),分別為:let-7e-5p、let-7i-5p、miR-7-5p、miR-22-3p、miR-23a-3p、miR-29a-3p、miR-125b-5p、miR-126-5p、miR-148a-3p、miR-184-5p、miR-181b-5p、miR-186-5p、miR-221-3p、miR-375、miR-574-5p和miR-941;在膀胱癌組中呈低表達(dá)的為7個(gè),分別為:miR-10a-3p、miR106b-5p、miR-200a-3p、miR-423-5p、miR-429、miR-455-5p 和 miR-505-3p。2.差異miRNAs分子的RT-qPCR驗(yàn)證:將上述23個(gè)呈差異表達(dá)的miRNAs分子在150例膀胱癌和150例健康對(duì)照尿液上清中進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)驗(yàn)證,結(jié)果顯示 miR-7-5p、miR-22-3p、miR-29a-3p、miR-126-5p 和 miR-375 在膀胱癌組的表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組(均P0.05),miR-200a-3p和miR-423-5p在膀胱癌組的表達(dá)顯著低于健康對(duì)照組(均P0.05)。ROC曲線評(píng)估尿液上清游離miR-7-5p、miR-22-3p、miR-29a-3p、miR-126-5p、miR-375、miR-200a-3p 和miR-423-5p診斷膀胱癌的曲線下面積(AUC)分別為:0.639、0.803、0.67、0.705、0.748、0.692 和 0.72。3.膀胱癌診斷模型的構(gòu)建:運(yùn)用logistic回歸分析將上述7個(gè)miRNAs分子構(gòu)建基于尿液游離miRNAs的膀胱癌診斷模型,得到膀胱癌的判別公式為:logit(p=BC)=-0.7792-(0.0823×miR-7-5p)-(0.2015×miR-22-3p)-(0.0223×miR-29a-3p)-(0.0793×miR-126-5p)+(0.1522×miR-200a-3p)-(0.1545×miR-375)+(0.2234×miR-423-5 p),該模型診斷膀胱癌的AUC為0.923 (95% CI: 0.886～0.950),敏感性為82%,特異度為96%。4.膀胱癌診斷模型的驗(yàn)證:在另外一組獨(dú)立樣本(120例膀胱癌和120例健康對(duì)照)尿液上清中驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),7-miRNAs診斷模型診斷膀胱癌的AUC為0.916(95% CI: 0.873～0.948),敏感性為85.00%,特異度為86.67%。診斷模型對(duì)Ta期膀胱癌的診斷AUC為0.864,敏感性為81.25%,特異度為85.00%;對(duì)T1期膀胱癌的診斷AUC為0.930,敏感性為89.74%,特異度為86.67%;對(duì)T2-T4期膀胱癌的診斷AUC為0.978,敏感性為97.78%,特異度為90.83%。膀胱癌診斷模型對(duì)低級(jí)別膀胱癌的診斷AUC為0.911,敏感性為80.88%,特異度為91.67%;對(duì)高級(jí)別膀胱癌的診斷AUC為0.958,敏感性為94.23%,特異度為89.17%。另外,傳統(tǒng)尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)對(duì)膀胱癌的診斷AUC為0.642 (95% CI: 0.577～0.702),敏感性為30.83%,特異度為97.50%。其對(duì)Ta、T1和T2-T4期膀胱癌的診斷AUC分別為0.531、0.628和0.724。結(jié)果顯示診斷模型對(duì)膀胱癌的診斷效能顯著優(yōu)于傳統(tǒng)尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。5. miRNAs分子表達(dá)與膀胱癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性:結(jié)果顯示,膀胱癌患者尿液游離miR-22-3p和miR-375表達(dá)上調(diào)以及miR-423-5p表達(dá)下調(diào)與患者較高的臨床分期顯著相關(guān)(P=0.02, P=0.03和P=0.03); miR-29a-3p和miR-375表達(dá)上調(diào)與患者局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)顯著相關(guān)(P=0.03和P=0.04); miR-7-5p的高表達(dá)與患者較高的病理分級(jí)顯著相關(guān)(P=0.02)。6. miRNAs分子表達(dá)與膀胱癌患者復(fù)發(fā)的相關(guān)性:分別對(duì)非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的患者進(jìn)行隨訪,Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,尿液游離miR-22-3p高表達(dá)的非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者的五年無(wú)復(fù)發(fā)生存率顯著低于miR-22-3p低表達(dá)的患者(P=0.002)。尿液游離miR-200a-3p低表達(dá)的非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者五年無(wú)復(fù)發(fā)生存率低于miR-200a-3p高表達(dá)的患者(P=0.040)。miR-7-5p、miR-29a-3p、miR-126-5p、miR-375 和 miR-423-5p 的表達(dá)水平與非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的復(fù)發(fā)無(wú)相關(guān)性。單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析顯示miR-22-3p、miR-200a-3p和臨床分期為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)因子(P= 0.004,P=0.045和P=0.006)。多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析顯示miR-22-3p、miR-200a-3p和臨床分期均為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(P=0.024, P=0.008和P=0.008)。另外,上述miRNAs分子的表達(dá)水平與肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的復(fù)發(fā)均無(wú)相關(guān)性。結(jié)論尿液游離 miR-7-5p、miR-22-3p、miR-29a-3p、miR-126-5p、miR-375、miR-200a-3p和miR-423-5p可以作為潛在腫瘤標(biāo)志物用于膀胱癌的診斷,構(gòu)建的7-miRNAs診斷模型能夠用于膀胱癌的早期診斷,并且顯著優(yōu)于傳統(tǒng)尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè):miR-22-3p和miR-200a-3p為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。上述結(jié)果為膀胱癌的無(wú)創(chuàng)性診斷和非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)提供了一條的新的途徑。第三部分:基于尿液microRNAs表達(dá)譜的膀胱癌分期預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建及臨床應(yīng)用研究目的臨床上膀胱癌可分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(pTis、pTa、pT1)和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(pT2-pT4),二者的生物學(xué)特性及采用的臨床治療方案顯著不同。非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌又稱表淺性膀胱癌,首選經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)進(jìn)行微創(chuàng)治療,預(yù)后相對(duì)較好;而肌層浸潤(rùn)性膀胱癌惡性程度高,發(fā)生轉(zhuǎn)移早,預(yù)后較差,5年生存率僅為50-60%,其標(biāo)準(zhǔn)治療方案則是采用根治性膀胱切除術(shù)同時(shí)行盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)。術(shù)前對(duì)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌進(jìn)行有效鑒別是治療方案選擇的關(guān)鍵,同時(shí)也是目前臨床亟待解決的難題。本研究旨在篩選肌層浸潤(rùn)性膀胱癌特異尿液游離miRNAs表達(dá)譜,進(jìn)而采用logistic回歸分析構(gòu)建基于尿液游離miRNAs的膀胱癌分期預(yù)測(cè)模型用于肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的術(shù)前預(yù)測(cè)。方法1.收集6例肌層浸潤(rùn)性膀胱癌、6例非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和6例健康對(duì)照尿液上清,采用Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)三組樣本進(jìn)行分析,初步篩選差異表達(dá)miRNAs作為候選miRNAs分子。2.采用RT-qPCR技術(shù)在113例肌層浸潤(rùn)性膀胱癌、113非例肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和156例健康對(duì)照尿液上清中對(duì)測(cè)序篩選出的候選miRNAs分子進(jìn)行驗(yàn)證。確定肌層浸潤(rùn)性膀胱癌特異的miRNAs分子,采用受試者工作曲線(ROC)評(píng)估上述特異的miRNAs分子對(duì)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的預(yù)測(cè)效能。3.運(yùn)用logistic回歸分析將驗(yàn)證出的對(duì)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌具有預(yù)測(cè)價(jià)值的miRNAs分子構(gòu)建膀胱癌分期預(yù)測(cè)模型。4.采用RT-qPCR技術(shù)在另外一組獨(dú)立樣本(102例非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和83例肌層浸潤(rùn)性膀胱癌)尿液上清中對(duì)膀胱癌分期預(yù)測(cè)模型進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)檢測(cè)上述185例膀胱癌患者的尿液脫落細(xì)胞學(xué),并統(tǒng)計(jì)膀胱癌病理分級(jí)信息,比較尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)、病理分級(jí)和膀胱癌預(yù)測(cè)模型三者對(duì)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的預(yù)測(cè)效能。5.采用單因素Kaplan-Meier分析方法,對(duì)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的預(yù)后進(jìn)行分析,并用log-rank檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)比較上述miRNAs分子與肌層浸潤(rùn)性膀胱癌預(yù)后的關(guān)系。進(jìn)一步采用單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型評(píng)估m(xù)iRNAs分子在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌預(yù)后中的獨(dú)立預(yù)測(cè)價(jià)值。結(jié)果1.差異miRNAs測(cè)序篩選:高通量測(cè)序結(jié)果顯示,大于50個(gè)拷貝的miRNAs分子在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中為235個(gè),非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中為188個(gè),健康對(duì)照者中為276個(gè)。根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn),大于50拷貝,在三組之間兩兩表達(dá)呈顯著差異且倍數(shù)大于 2 的 miRNAs分子為 24個(gè):let-7a-5p、let-7b-5p、miR-1、miR-100-3p、miR-126-5p、miR-133a、miR-143-3p、miR-146a-5p、miR-148a-3p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-186-5p、miR-194-5p、miR-200a-5p、miR-22-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-28-3p、miR-29a-3p、miR-30b-5p、miR-320a、miR-34a-5p、miR-375和 miR-1246。2.候選miRNAs分子的RT-qPCR驗(yàn)證:將上述24個(gè)差異表達(dá)的miRNAs分子在113例肌層浸潤(rùn)性膀胱癌、113例非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和156例健康對(duì)照中尿液上清中進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示miR-24-3p和miR-1246在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組表達(dá)顯著高于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組和健康對(duì)照組(均P0.05),同時(shí),其在非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組(均P0.05)。ROC分析顯示,miR-24-3p和miR-1246預(yù)測(cè)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的曲線下面積(AUC)分別為0.791和0.675。3.膀胱癌分期預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建:將上述2個(gè)miRNAs分子構(gòu)建基于尿液游離miRNAs的膀胱癌分期預(yù)測(cè)模型,得到肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的判別公式為:logit(p=MIBC)=0.8575—0.2156×miR-24-3p-0.2133×miR-1246,該分期預(yù)測(cè)模型對(duì)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的預(yù)測(cè)AUC為0.825(95% CI: 0.769～0.872),敏感性為76.11%,特異度為74.34%。4.膀胱癌分期預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證:在另外一組獨(dú)立樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),分期預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的AUC為0.808 (95% CI: 0.744～0.862),敏感性為75.9%,特異度為75.49%,顯著高于臨床分級(jí)(AUC: 0.709, 95%CI:0.638～0.773)和尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)(AUC: 0.561, 95% CI: 0.487～0.634)。5. miRNAs分子表達(dá)與肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者預(yù)后的相關(guān)性:對(duì)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的患者進(jìn)行預(yù)后隨訪,Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,尿液游離miR-24-3p高表達(dá)的肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者的五年生存率顯著低于miR-24-3p低表達(dá)的患者(P0.05)。miR-1246的表達(dá)與肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者的預(yù)后無(wú)相關(guān)性。單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析顯示miR-24-3p和臨床分期為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌預(yù)后判斷因子(P= 0.008和P=0.008)。多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析顯示miR-24-3p和臨床分期均為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌預(yù)后的獨(dú)立判斷因子(P=0.004和 = 0.014)。結(jié)論尿液游離miR-24-3p和miR-1246可以作為潛在腫瘤標(biāo)志物用于膀胱癌的分期預(yù)測(cè),構(gòu)建的2-miRNAs膀胱癌分期預(yù)測(cè)模型能夠在術(shù)前預(yù)測(cè)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌,并且顯著優(yōu)于傳統(tǒng)尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)和病理分級(jí);miR-24-3p為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌預(yù)后的獨(dú)立判斷因子。上述結(jié)果為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的術(shù)前預(yù)測(cè)和預(yù)后判斷提供了一條的新的途徑。第四部分:microRNAs分子在膀胱癌組織中表達(dá)及生物學(xué)功能研究研究目的本研究旨在檢測(cè)膀胱癌分期預(yù)測(cè)模型中的microRNAs (miRNAs)分子在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織中的表達(dá)情況。通過(guò)體外調(diào)控膀胱癌細(xì)胞系中miRNAs分子的表達(dá)水平,進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn),探討上述miRNAs分子在膀胱癌增殖、遷移、侵襲及凋亡等過(guò)程中的生物學(xué)功能,明確其在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為尋找膀胱癌潛在的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。方法1.采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)35例肌層浸潤(rùn)性膀胱癌及35例非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌新鮮冰凍組織及T24膀胱癌細(xì)胞系中miR-24-3p和miR-1246的表達(dá)情況。選取差異表達(dá)miRNAs分子,進(jìn)一步檢測(cè)其在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織及配對(duì)癌旁正常組織中的表達(dá)情況。2.體外用脂質(zhì)體2000將miR-1246 mimics、miR-1246 inhibitor和對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照序列轉(zhuǎn)染T24膀胱癌細(xì)胞系,同時(shí)利用RT-qPCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。3.采用CCK8實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)及Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后T24膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力及凋亡的變化。結(jié)果1.結(jié)果顯示,miR-1246在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織中的表達(dá)水平顯著高于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織(P0.05),而miR-24-3p表達(dá)在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織與非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。進(jìn)一步檢測(cè)miR-1246在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織與配對(duì)癌旁正常組織的表達(dá)情況,結(jié)果顯示相比配對(duì)癌旁正常組織,77%的肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織中miR-1246的表達(dá)水平顯著上調(diào)(大于2倍)。2.相比于mock組和miR-NC組,轉(zhuǎn)染miR-1246mimics24小時(shí)后,T24膀胱癌細(xì)胞中miR-1246的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P0.001)。相比于mock組和miR-NC組,轉(zhuǎn)染miR-1246 inhibitor24小時(shí)后,T24膀胱癌細(xì)胞中miR-1246的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P 0.05)。3.相比于mock組和miR-NC組,轉(zhuǎn)染miR-1246 mimics的T24膀胱癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)增殖均明顯增快,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。相比于 mock 組和 miR-NC 組,轉(zhuǎn)染 miR-1246 inhibitor 的 T24 膀胱癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)后增殖明顯減慢,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,miR-1246mimics組愈合率顯著高于mock組和miR-NC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); miR-1246inhibitor組愈合率明顯低于mock組和miR-NC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示,T24膀胱癌細(xì)胞miR-1246mimics組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于mock組和miR-NC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); T24膀胱癌細(xì)胞miR-1246inhibitor組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于mock組和miR-NC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,T24膀胱癌細(xì)胞miR-1246mimics組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于mock組和miR-NC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); T24膀胱癌細(xì)胞miR-1246inhibitor組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于mock組和miR-NC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示,T24膀胱癌細(xì)胞miR-1246mimics組凋亡率與mock組和miR-NC組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。另外,T24膀胱癌細(xì)胞miR-1246inhibitor組凋亡率與mock組和miR-NC組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論相比于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌,miR-1246在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織中表達(dá)水平顯著上調(diào)。進(jìn)一步體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-1246在膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用,顯著促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展。本研究將為尋找膀胱癌新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.14
【圖文】：

圖１．候選內(nèi)參基因的Ｃｑ值逡逑膀胱癌組和健康對(duì)照組兩組間８?jìng)�(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)的Ｃｑ值，８?jìng)�(gè)在兩組間表達(dá)無(wú)差異（＾＞０．０５）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．邋Ｃｑ邋ｖａｌｕｅｓ邋ｏｆ邋ｃａｎｄｉｄａｔｅ邋ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ邋ｇｅｎｅｓ逡逑Ｃｑ邋ｖａｌｕｅｓ邋ｏｆ邋ｅｉｇｈｔ邋ｃａｎｄｉｄａｔｅ邋ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ邋ｇｅｎｅｓ邋ｉｎ邋ＢＣｓ邋ａｎｄ邋ｃｏｎｔｒｏｌｓ．邋Ｎｏ邋ｓｉｇｎｆｅｒｅｎｃｅ邋ｗａｓ邋ｆｏｕｎｄ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｔｈｅ邋ｔｗｏ邋ｇｒｏｕｐｓ邋（＾＞

圖２．邋ＲＯＣ曲線分析ｍｉＲ－２４－３ｐ對(duì)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的預(yù)測(cè)效能，訓(xùn)練組（ａ）和逡逑驗(yàn)證組（ｃ）；邋ＲＯＣ曲線分析ｍｉＲ－１２４６對(duì)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的預(yù)測(cè)效能，訓(xùn)練組逡逑（ｂ）和驗(yàn)證組（ｄ）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．邋ＲＯＣ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－２４－３ｐ邋ｆｏｒ邋ＭＩＢＣ邋ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｔｒａｉｎｉｎｇ邋ｓｅｔ邋（ａ）邋ａｎｄ逡逑ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｓｅｔ邋（ｃ）；邋ＲＯＣ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－１２４６邋ｆｏｒ邋ＭＩＢＣ邋ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｔｒａｉｎｉｎｇ邋ｓｅｔ逡逑（ｂ）邋ａｎｄ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｓｅｔ邋（ｄ）．逡逑

圖３．邐（ａ）邋ＲＯＣ曲線分析２－ｍｉＲＮＡｓ預(yù)測(cè)模型對(duì)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的預(yù)測(cè)效（訓(xùn)練組）；（ｂ）邋ＲＯＣ曲線分析２－ｍｉＲＮＡ預(yù)測(cè)模型對(duì)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的預(yù)效能（驗(yàn)證組）；（ｃ）病理分級(jí)對(duì)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的預(yù)測(cè)效能；（ｄ）尿液脫細(xì)胞學(xué)對(duì)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的預(yù)測(cè)效能。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．邋ＲＯＣ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｗｏ－ｍｉＲＮＡ邋ｐａｎｅｌ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｔｒａｉｎｉｎｇ邋ｓｅｔ邋（ａ），邋ｔｗｏ－ｍｉＲＮｐａｎｅｌ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｓｅｔ邋（ｂ），邋ｇｒａｄｅ邋（ｃ）邋ａｎｄ邋ｕｒｉｎａｒｙ邋ｃｙｔｏｌｏｇｙ邋（ｄ）邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｓｆｏｒ邋ＭＩＢＣ邋ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．逡逑

本文編號(hào)：2768600