【摘要】：研究背景膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率在我國男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中均居首位,嚴重威脅人類健康。臨床上,膀胱癌可分為非肌層浸潤性膀胱癌(pTis、pTa、pT1)和肌層浸潤性膀胱癌(pT2-pT4),二者的生物學特性及采用的治療方案顯著不同。非肌層浸潤性膀胱癌又稱為表淺性膀胱癌,首選經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(TUR-BT)進行微創(chuàng)治療,預后相對較好;而肌層浸潤性膀胱癌惡性程度高,發(fā)生轉移早,預后較差,5年生存率僅為50-60%,其標準治療方案則是采用根治性膀胱切除術同時行盆腔淋巴結清掃術。膀胱癌患者初診時30%已發(fā)生肌層浸潤,而在非肌層浸潤性膀胱癌患者中,仍有30%會復發(fā)為浸潤性膀胱癌。對膀胱癌進行早期診斷并對肌層浸潤性膀胱癌和非肌層浸潤性膀胱癌進行術前有效鑒別是膀胱癌治療方案選擇的關鍵。目前臨床上診斷膀胱癌主要依賴于膀胱鏡、尿脫落細胞學和影像學檢查等。膀胱鏡是膀胱癌診斷的常用方法,可造成不同程度的尿道和膀胱損傷以及感染等并發(fā)癥;尿脫落細胞學檢查具有非侵入性、特異性高等優(yōu)點,但其敏感性低于50%,對早期患者僅為30%,易受檢測者主觀因素的影響;CT和超聲檢查是目前診斷膀胱癌及術前分期最常用的影像學檢查方法,但不易發(fā)現(xiàn)膀胱內(nèi)微小病變,使其對膀胱癌分期預測的價值受到一定限制;TUR-BT主要用于非肌層浸潤性膀胱癌的治療,同時也可為肌層浸潤性膀胱癌提供分期依據(jù),但由于手術本身的風險及依從性差限制了其在膀胱癌分期預測上的廣泛應用。尋找敏感性、特異性高的新型生物標志物用于膀胱癌早期發(fā)現(xiàn)并對肌層浸潤性膀胱癌進行術前預測仍是目前關注的焦點。MicroRNAs (miRNAs)通過與靶mRNA分子完全或不完全配對結合從而在轉錄后水平調(diào)控基因的表達,在腫瘤發(fā)生發(fā)展調(diào)控網(wǎng)絡中扮演著至關重要的角色。對不同類型腫瘤中的miRNAs分析發(fā)現(xiàn),miRNAs表達譜具有明顯的腫瘤特異性,并且在腫瘤的不同分期中其也具有特定的表達模式,提示其可作為腫瘤診斷及分期預測的潛在標志物。近年研究表明,尿液上清中存在豐富且穩(wěn)定的miRNAs,其與泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關,為腫瘤的無創(chuàng)診斷提供了新思路。篩選鑒定尿液游離miRNAs表達譜并引入構建模型從而用于膀胱癌的無創(chuàng)性診斷和肌層浸潤性膀胱癌的預測,將有助于膀胱癌的早期發(fā)現(xiàn)及臨床治療方案的選擇。RT-qPCR是目前miRNAs定量檢測最常用的技術手段,其檢測數(shù)據(jù)標準化主要選用內(nèi)參基因進行校正。采用一種最適的內(nèi)參基因來對miRNAs的表達量進行校正可以提高RT-qPCR檢測的重復性和靈敏度。對于膀胱癌尿液游離miRNAs RT-qPCR定量檢測,目前尚無最適內(nèi)參基因系統(tǒng)篩選的相關研究。鑒于此,本課題首先采用高通量測序技術結合RT-qPCR技術系統(tǒng)篩選并確定可用于尿液游離miRNAs定量檢測的最適內(nèi)參基因;以篩選的最適內(nèi)參基因為參照,進一步篩選膀胱癌特異尿液游離miRNAs差異表達譜,結合logistic回歸分析構建膀胱癌診斷模型并評價其在膀胱癌早期診斷中的應用價值;同時,采用上述技術手段系統(tǒng)篩選對肌層浸潤性膀胱癌有預測價值的尿液miRNAs差異表達譜,結合logistic回歸分析構建膀胱癌分期預測模型并評價其在肌層浸潤性膀胱癌預測中的應用價值;最后通過膀胱癌組織樣本檢測及體外細胞實驗,研究相關miRNAs分子在膀胱癌中的生物學功能。本研究將建立基于尿液游離miRNAs新型生物標志物的膀胱癌診斷和分期預測模型,為膀胱癌的無創(chuàng)診斷及分期預測開辟新途徑,并為膀胱癌的有效治療提供新靶點。第一部分膀胱癌尿液microRNAs RT-qPCR檢測最適內(nèi)參基因的選擇與驗證研究目的實時熒光定量PCR (RT-qPCR)是目前尿液游離microRNAs (miRNAs)檢測最常用的方法,選擇合適的內(nèi)參基因進行數(shù)據(jù)標準化是獲得可信RT-qPCR定量數(shù)據(jù)的重要保證。本研究旨在對膀胱癌尿液游離miRNAs RT-qPCR檢測的內(nèi)參基因進行系統(tǒng)篩選和驗證,確定可用于膀胱癌尿液游離miRNAs RT-qPCR檢測的最適內(nèi)參基因。方法1.收集6例膀胱癌和6例健康對照尿液上清,采用Miseq高通量測序技術對兩組樣本進行分析,選擇拷貝數(shù)大于50,在兩組樣本中表達無差異且在兩組之間倍數(shù)小于1.2的miRNAs分子作為候選的內(nèi)參基因。2.采用RT-qPCR技術在80例膀胱癌和80例健康對照尿液上清中對測序篩選出的候選內(nèi)參基因和目前常用內(nèi)參基因U6 snRNA進行初步驗證。3.利用NormFinder和geNorm軟件評估內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性,確定最適的內(nèi)參基因。4.采用RT-qPCR技術在63例膀胱癌和63例健康對照尿液上清中對篩選確定的最適內(nèi)參基因進行評估。結果1.候選內(nèi)參基因的測序篩選:膀胱癌組和健康對照者組比較發(fā)現(xiàn),根據(jù)篩選標準,拷貝數(shù)大于50,兩組間表達無差異且兩組倍數(shù)小于1.2的miRNAs分子為 13 個(let-7b-5p、miR-532-5p、miR-23b-5p、miR-100-5p、miR-20a-5p、miR-28-3p、miR-34a-5p、miR-17-5p、miR-133a-3p、miR-194-5p、miR-30b-5p、miR-98-5p 和miR-99b-5p),同時也將U6 snRNA作為候選內(nèi)參基因納入進行下一步驗證。2.候選內(nèi)參基因的RT-qPCR驗證:在上述14個候選的內(nèi)參基因中,有4個 miRNAs 分子(miR-17-5p、miR-133a-3p、miR-30b-5p和miR-98-5p)在尿液上清標本中無法檢測到;2個miRNAs分子(miR-194-5p和miR-99b-5p)的RT-qPCR 檢測的平均 Cq 值大于 35; 7 個 miRNAs (miR-100-5p、miR-20a-5p、miR-23b-5p、miR-28-3p、miR-34a-5p、miR-532-5p 和 let-7b-5p)和 U6 snRNA在所有尿液上清樣本中均可檢測到且Cq均值小于35。3.確定的內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性評估:利用NormFinder和geNorm兩個軟件評估上述7個確定的miRNAs分子和U6 snRNA的穩(wěn)定性,兩個軟件均顯示let-7b-5p是表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因,let-7b-5p和miR-532-5p組合是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合。4.最適內(nèi)參基因的驗證:運用另外一組獨立的樣本(63例膀胱癌和63例健康對照尿液上清標本)進行最適內(nèi)參基因的驗證,結果顯示let-7b-5p、miR-532-5p及l(fā)et-7b-5p和miR-532-5p組合在膀胱癌組和健康對照組兩組間表達均無差異(均P0.05),在不同分期的膀胱癌患者中表達也無差異(均P0.05)。結論let-7b-5p和miR-532-5p組合可作為膀胱癌和健康對照尿液游離miRNAs RT-qPCR檢測的最適內(nèi)參基因。第二部分基于尿液microRNAs表達譜的膀胱癌診斷模型的構建及臨床應用研究目的膀胱癌在我國的發(fā)病率和死亡率均占男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的首位,且呈逐年上升趨勢。目前臨床上診斷膀胱癌的主要技術手段仍依賴于膀胱鏡、尿脫落細胞學檢測和影像學檢查等,它們雖各有優(yōu)勢,但或具侵入性,或依從性差,或敏感性和特異性不足,尚無法滿足臨床需求。研究發(fā)現(xiàn),尿液上清中存在豐富而穩(wěn)定的游離microRNAs (miRNAs),其與泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關,為腫瘤的無創(chuàng)性診斷開辟了一條新的途徑。本研究旨在系統(tǒng)篩選膀胱癌特異尿液游離miRNAs表達譜,進一步運用logistic回歸分析構建基于尿液游離miRNAs的膀胱癌診斷模型用于膀胱癌的診斷。方法1.收集6例膀胱癌和6例健康對照尿液上清,采用Miseq高通量測序技術對兩組樣本進行分析,選擇在兩組樣本中表達呈顯著差異且兩組之間倍數(shù)大于2的miRNAs作為候選miRNAs分子。2.采用RT-qPCR技術在150例膀胱癌和150例健康對照尿液上清中對上一步測序篩選出的候選miRNAs分子進行驗證。并采用受試者工作曲線(ROC)評估驗證后的呈差異表達的miRNAs分子對膀胱癌的診斷效能。3.通過logistic回歸分析將驗證出的對膀胱癌具有診斷價值的miRNAs分子構建膀胱癌診斷模型。4.采用RT-qPCR技術在另外一組獨立樣本(120例膀胱癌和120例健康對照)尿液上清中對膀胱癌診斷模型進行驗證。同時檢測上述240例受試者的尿液脫落細胞學,并比較尿液脫落細胞學檢測和診斷模型對膀胱癌的早期診斷價值。5.采用Mann-Whitney U或Kruskal-Wallis檢驗統(tǒng)計分析上述具有診斷價值的miRNAs分子的表達與膀胱癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關性。6.采用單因素Kaplan-Meier分析方法,對膀胱癌患者的復發(fā)情況進行分析,并用log-rank test統(tǒng)計比較上述miRNAs分子與膀胱癌復發(fā)的關系。進一步采用單因素和多因素Cox比例風險回歸模型評估m(xù)iRNAs分子在膀胱癌復發(fā)中的預測價值。結果1.差異miRNAs測序篩選:高通量測序結果顯示,膀胱癌和健康對照尿液上清中拷貝數(shù)大于50的miRNAs分子分別為256和308個。在兩組間表達呈顯著差異且倍數(shù)大于2的miRNAs分子為23個,其中在膀胱癌組中呈高表達的為16 個,分別為:let-7e-5p、let-7i-5p、miR-7-5p、miR-22-3p、miR-23a-3p、miR-29a-3p、miR-125b-5p、miR-126-5p、miR-148a-3p、miR-184-5p、miR-181b-5p、miR-186-5p、miR-221-3p、miR-375、miR-574-5p和miR-941;在膀胱癌組中呈低表達的為7個,分別為:miR-10a-3p、miR106b-5p、miR-200a-3p、miR-423-5p、miR-429、miR-455-5p 和 miR-505-3p。2.差異miRNAs分子的RT-qPCR驗證:將上述23個呈差異表達的miRNAs分子在150例膀胱癌和150例健康對照尿液上清中進行RT-qPCR檢測驗證,結果顯示 miR-7-5p、miR-22-3p、miR-29a-3p、miR-126-5p 和 miR-375 在膀胱癌組的表達顯著高于健康對照組(均P0.05),miR-200a-3p和miR-423-5p在膀胱癌組的表達顯著低于健康對照組(均P0.05)。ROC曲線評估尿液上清游離miR-7-5p、miR-22-3p、miR-29a-3p、miR-126-5p、miR-375、miR-200a-3p 和miR-423-5p診斷膀胱癌的曲線下面積(AUC)分別為:0.639、0.803、0.67、0.705、0.748、0.692 和 0.72。3.膀胱癌診斷模型的構建:運用logistic回歸分析將上述7個miRNAs分子構建基于尿液游離miRNAs的膀胱癌診斷模型,得到膀胱癌的判別公式為:logit(p=BC)=-0.7792-(0.0823×miR-7-5p)-(0.2015×miR-22-3p)-(0.0223×miR-29a-3p)-(0.0793×miR-126-5p)+(0.1522×miR-200a-3p)-(0.1545×miR-375)+(0.2234×miR-423-5 p),該模型診斷膀胱癌的AUC為0.923 (95% CI: 0.886～0.950),敏感性為82%,特異度為96%。4.膀胱癌診斷模型的驗證:在另外一組獨立樣本(120例膀胱癌和120例健康對照)尿液上清中驗證發(fā)現(xiàn),7-miRNAs診斷模型診斷膀胱癌的AUC為0.916(95% CI: 0.873～0.948),敏感性為85.00%,特異度為86.67%。診斷模型對Ta期膀胱癌的診斷AUC為0.864,敏感性為81.25%,特異度為85.00%;對T1期膀胱癌的診斷AUC為0.930,敏感性為89.74%,特異度為86.67%;對T2-T4期膀胱癌的診斷AUC為0.978,敏感性為97.78%,特異度為90.83%。膀胱癌診斷模型對低級別膀胱癌的診斷AUC為0.911,敏感性為80.88%,特異度為91.67%;對高級別膀胱癌的診斷AUC為0.958,敏感性為94.23%,特異度為89.17%。另外,傳統(tǒng)尿液脫落細胞學檢測對膀胱癌的診斷AUC為0.642 (95% CI: 0.577～0.702),敏感性為30.83%,特異度為97.50%。其對Ta、T1和T2-T4期膀胱癌的診斷AUC分別為0.531、0.628和0.724。結果顯示診斷模型對膀胱癌的診斷效能顯著優(yōu)于傳統(tǒng)尿液脫落細胞學檢測。5. miRNAs分子表達與膀胱癌患者臨床病理參數(shù)的相關性:結果顯示,膀胱癌患者尿液游離miR-22-3p和miR-375表達上調(diào)以及miR-423-5p表達下調(diào)與患者較高的臨床分期顯著相關(P=0.02, P=0.03和P=0.03); miR-29a-3p和miR-375表達上調(diào)與患者局部淋巴結轉移狀態(tài)顯著相關(P=0.03和P=0.04); miR-7-5p的高表達與患者較高的病理分級顯著相關(P=0.02)。6. miRNAs分子表達與膀胱癌患者復發(fā)的相關性:分別對非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌的患者進行隨訪,Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,尿液游離miR-22-3p高表達的非肌層浸潤性膀胱癌患者的五年無復發(fā)生存率顯著低于miR-22-3p低表達的患者(P=0.002)。尿液游離miR-200a-3p低表達的非肌層浸潤性膀胱癌患者五年無復發(fā)生存率低于miR-200a-3p高表達的患者(P=0.040)。miR-7-5p、miR-29a-3p、miR-126-5p、miR-375 和 miR-423-5p 的表達水平與非肌層浸潤性膀胱癌的復發(fā)無相關性。單因素Cox比例風險回歸模型分析顯示miR-22-3p、miR-200a-3p和臨床分期為非肌層浸潤性膀胱癌復發(fā)的預測因子(P= 0.004,P=0.045和P=0.006)。多因素Cox比例風險回歸模型分析顯示miR-22-3p、miR-200a-3p和臨床分期均為非肌層浸潤性膀胱癌復發(fā)的獨立預測因子(P=0.024, P=0.008和P=0.008)。另外,上述miRNAs分子的表達水平與肌層浸潤性膀胱癌的復發(fā)均無相關性。結論尿液游離 miR-7-5p、miR-22-3p、miR-29a-3p、miR-126-5p、miR-375、miR-200a-3p和miR-423-5p可以作為潛在腫瘤標志物用于膀胱癌的診斷,構建的7-miRNAs診斷模型能夠用于膀胱癌的早期診斷,并且顯著優(yōu)于傳統(tǒng)尿液脫落細胞學檢測:miR-22-3p和miR-200a-3p為非肌層浸潤性膀胱癌復發(fā)的獨立預測因子。上述結果為膀胱癌的無創(chuàng)性診斷和非肌層浸潤性膀胱癌的復發(fā)預測提供了一條的新的途徑。第三部分:基于尿液microRNAs表達譜的膀胱癌分期預測模型的構建及臨床應用研究目的臨床上膀胱癌可分為非肌層浸潤性膀胱癌(pTis、pTa、pT1)和肌層浸潤性膀胱癌(pT2-pT4),二者的生物學特性及采用的臨床治療方案顯著不同。非肌層浸潤性膀胱癌又稱表淺性膀胱癌,首選經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術進行微創(chuàng)治療,預后相對較好;而肌層浸潤性膀胱癌惡性程度高,發(fā)生轉移早,預后較差,5年生存率僅為50-60%,其標準治療方案則是采用根治性膀胱切除術同時行盆腔淋巴結清掃術。術前對肌層浸潤性膀胱癌和非肌層浸潤性膀胱癌進行有效鑒別是治療方案選擇的關鍵,同時也是目前臨床亟待解決的難題。本研究旨在篩選肌層浸潤性膀胱癌特異尿液游離miRNAs表達譜,進而采用logistic回歸分析構建基于尿液游離miRNAs的膀胱癌分期預測模型用于肌層浸潤性膀胱癌的術前預測。方法1.收集6例肌層浸潤性膀胱癌、6例非肌層浸潤性膀胱癌和6例健康對照尿液上清,采用Miseq高通量測序技術對三組樣本進行分析,初步篩選差異表達miRNAs作為候選miRNAs分子。2.采用RT-qPCR技術在113例肌層浸潤性膀胱癌、113非例肌層浸潤性膀胱癌和156例健康對照尿液上清中對測序篩選出的候選miRNAs分子進行驗證。確定肌層浸潤性膀胱癌特異的miRNAs分子,采用受試者工作曲線(ROC)評估上述特異的miRNAs分子對肌層浸潤性膀胱癌的預測效能。3.運用logistic回歸分析將驗證出的對肌層浸潤性膀胱癌具有預測價值的miRNAs分子構建膀胱癌分期預測模型。4.采用RT-qPCR技術在另外一組獨立樣本(102例非肌層浸潤性膀胱癌和83例肌層浸潤性膀胱癌)尿液上清中對膀胱癌分期預測模型進行驗證。同時檢測上述185例膀胱癌患者的尿液脫落細胞學,并統(tǒng)計膀胱癌病理分級信息,比較尿液脫落細胞學檢測、病理分級和膀胱癌預測模型三者對肌層浸潤性膀胱癌的預測效能。5.采用單因素Kaplan-Meier分析方法,對肌層浸潤性膀胱癌的預后進行分析,并用log-rank檢驗統(tǒng)計比較上述miRNAs分子與肌層浸潤性膀胱癌預后的關系。進一步采用單因素和多因素Cox比例風險回歸模型評估m(xù)iRNAs分子在肌層浸潤性膀胱癌預后中的獨立預測價值。結果1.差異miRNAs測序篩選:高通量測序結果顯示,大于50個拷貝的miRNAs分子在肌層浸潤性膀胱癌中為235個,非肌層浸潤性膀胱癌中為188個,健康對照者中為276個。根據(jù)篩選標準,大于50拷貝,在三組之間兩兩表達呈顯著差異且倍數(shù)大于 2 的 miRNAs分子為 24個:let-7a-5p、let-7b-5p、miR-1、miR-100-3p、miR-126-5p、miR-133a、miR-143-3p、miR-146a-5p、miR-148a-3p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-186-5p、miR-194-5p、miR-200a-5p、miR-22-3p、miR-23b-3p、miR-24-3p、miR-28-3p、miR-29a-3p、miR-30b-5p、miR-320a、miR-34a-5p、miR-375和 miR-1246。2.候選miRNAs分子的RT-qPCR驗證:將上述24個差異表達的miRNAs分子在113例肌層浸潤性膀胱癌、113例非肌層浸潤性膀胱癌和156例健康對照中尿液上清中進行RT-qPCR驗證,結果顯示miR-24-3p和miR-1246在肌層浸潤性膀胱癌組表達顯著高于非肌層浸潤性膀胱癌組和健康對照組(均P0.05),同時,其在非肌層浸潤性膀胱癌組表達顯著高于健康對照組(均P0.05)。ROC分析顯示,miR-24-3p和miR-1246預測肌層浸潤性膀胱癌的曲線下面積(AUC)分別為0.791和0.675。3.膀胱癌分期預測模型的構建:將上述2個miRNAs分子構建基于尿液游離miRNAs的膀胱癌分期預測模型,得到肌層浸潤性膀胱癌的判別公式為:logit(p=MIBC)=0.8575—0.2156×miR-24-3p-0.2133×miR-1246,該分期預測模型對肌層浸潤性膀胱癌的預測AUC為0.825(95% CI: 0.769～0.872),敏感性為76.11%,特異度為74.34%。4.膀胱癌分期預測模型的驗證:在另外一組獨立樣本中進一步驗證發(fā)現(xiàn),分期預測模型預測肌層浸潤性膀胱癌的AUC為0.808 (95% CI: 0.744～0.862),敏感性為75.9%,特異度為75.49%,顯著高于臨床分級(AUC: 0.709, 95%CI:0.638～0.773)和尿液脫落細胞學檢測(AUC: 0.561, 95% CI: 0.487～0.634)。5. miRNAs分子表達與肌層浸潤性膀胱癌患者預后的相關性:對肌層浸潤性膀胱癌的患者進行預后隨訪,Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,尿液游離miR-24-3p高表達的肌層浸潤性膀胱癌患者的五年生存率顯著低于miR-24-3p低表達的患者(P0.05)。miR-1246的表達與肌層浸潤性膀胱癌患者的預后無相關性。單因素Cox比例風險回歸模型分析顯示miR-24-3p和臨床分期為肌層浸潤性膀胱癌預后判斷因子(P= 0.008和P=0.008)。多因素Cox比例風險回歸模型分析顯示miR-24-3p和臨床分期均為肌層浸潤性膀胱癌預后的獨立判斷因子(P=0.004和 = 0.014)。結論尿液游離miR-24-3p和miR-1246可以作為潛在腫瘤標志物用于膀胱癌的分期預測,構建的2-miRNAs膀胱癌分期預測模型能夠在術前預測肌層浸潤性膀胱癌,并且顯著優(yōu)于傳統(tǒng)尿液脫落細胞學檢測和病理分級;miR-24-3p為肌層浸潤性膀胱癌預后的獨立判斷因子。上述結果為肌層浸潤性膀胱癌的術前預測和預后判斷提供了一條的新的途徑。第四部分:microRNAs分子在膀胱癌組織中表達及生物學功能研究研究目的本研究旨在檢測膀胱癌分期預測模型中的microRNAs (miRNAs)分子在肌層浸潤性膀胱癌和非肌層浸潤性膀胱癌組織中的表達情況。通過體外調(diào)控膀胱癌細胞系中miRNAs分子的表達水平,進行相關細胞功能實驗,探討上述miRNAs分子在膀胱癌增殖、遷移、侵襲及凋亡等過程中的生物學功能,明確其在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為尋找膀胱癌潛在的治療靶點提供理論依據(jù)。方法1.采用RT-qPCR技術檢測35例肌層浸潤性膀胱癌及35例非肌層浸潤性膀胱癌新鮮冰凍組織及T24膀胱癌細胞系中miR-24-3p和miR-1246的表達情況。選取差異表達miRNAs分子,進一步檢測其在肌層浸潤性膀胱癌組織及配對癌旁正常組織中的表達情況。2.體外用脂質體2000將miR-1246 mimics、miR-1246 inhibitor和對應的陰性對照序列轉染T24膀胱癌細胞系,同時利用RT-qPCR方法檢測轉染效率。3.采用CCK8實驗、劃痕實驗、Transwell遷移實驗、Transwell侵襲實驗及Annexin V-FITC/PI雙標流式細胞學實驗檢測轉染后T24膀胱癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力及凋亡的變化。結果1.結果顯示,miR-1246在肌層浸潤性膀胱癌組織中的表達水平顯著高于非肌層浸潤性膀胱癌組織(P0.05),而miR-24-3p表達在肌層浸潤性膀胱癌組織與非肌層浸潤性膀胱癌組織之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。進一步檢測miR-1246在肌層浸潤性膀胱癌組織與配對癌旁正常組織的表達情況,結果顯示相比配對癌旁正常組織,77%的肌層浸潤性膀胱癌組織中miR-1246的表達水平顯著上調(diào)(大于2倍)。2.相比于mock組和miR-NC組,轉染miR-1246mimics24小時后,T24膀胱癌細胞中miR-1246的表達水平顯著上調(diào)(P0.001)。相比于mock組和miR-NC組,轉染miR-1246 inhibitor24小時后,T24膀胱癌細胞中miR-1246的表達水平顯著下調(diào)(P 0.05)。3.相比于mock組和miR-NC組,轉染miR-1246 mimics的T24膀胱癌細胞在轉染后48小時、72小時、96小時增殖均明顯增快,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。相比于 mock 組和 miR-NC 組,轉染 miR-1246 inhibitor 的 T24 膀胱癌細胞在轉染48小時、72小時、96小時后增殖明顯減慢,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.劃痕實驗顯示,轉染24小時后,miR-1246mimics組愈合率顯著高于mock組和miR-NC組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05); miR-1246inhibitor組愈合率明顯低于mock組和miR-NC組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Transwell遷移實驗顯示,T24膀胱癌細胞miR-1246mimics組穿膜細胞數(shù)明顯高于mock組和miR-NC組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05); T24膀胱癌細胞miR-1246inhibitor組穿膜細胞數(shù)明顯低于mock組和miR-NC組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Transwell侵襲實驗顯示,T24膀胱癌細胞miR-1246mimics組穿膜細胞數(shù)明顯高于mock組和miR-NC組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05); T24膀胱癌細胞miR-1246inhibitor組穿膜細胞數(shù)明顯低于mock組和miR-NC組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.細胞凋亡實驗顯示,T24膀胱癌細胞miR-1246mimics組凋亡率與mock組和miR-NC組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。另外,T24膀胱癌細胞miR-1246inhibitor組凋亡率與mock組和miR-NC組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論相比于非肌層浸潤性膀胱癌,miR-1246在肌層浸潤性膀胱癌組織中表達水平顯著上調(diào)。進一步體外細胞功能實驗發(fā)現(xiàn),miR-1246在膀胱癌細胞增殖、侵襲及轉移等惡性生物學行為中發(fā)揮重要作用,顯著促進膀胱癌進展。本研究將為尋找膀胱癌新的治療靶點提供理論依據(jù)。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.14
【圖文】：

圖１．候選內(nèi)參基因的Ｃｑ值逡逑膀胱癌組和健康對照組兩組間８個候選內(nèi)參基因表達的Ｃｑ值，８個在兩組間表達無差異（＾＞０．０５）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．邋Ｃｑ邋ｖａｌｕｅｓ邋ｏｆ邋ｃａｎｄｉｄａｔｅ邋ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ邋ｇｅｎｅｓ逡逑Ｃｑ邋ｖａｌｕｅｓ邋ｏｆ邋ｅｉｇｈｔ邋ｃａｎｄｉｄａｔｅ邋ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ邋ｇｅｎｅｓ邋ｉｎ邋ＢＣｓ邋ａｎｄ邋ｃｏｎｔｒｏｌｓ．邋Ｎｏ邋ｓｉｇｎｆｅｒｅｎｃｅ邋ｗａｓ邋ｆｏｕｎｄ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｔｈｅ邋ｔｗｏ邋ｇｒｏｕｐｓ邋（＾＞

圖２．邋ＲＯＣ曲線分析ｍｉＲ－２４－３ｐ對肌層浸潤性膀胱癌的預測效能，訓練組（ａ）和逡逑驗證組（ｃ）；邋ＲＯＣ曲線分析ｍｉＲ－１２４６對肌層浸潤性膀胱癌的預測效能，訓練組逡逑（ｂ）和驗證組（ｄ）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．邋ＲＯＣ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－２４－３ｐ邋ｆｏｒ邋ＭＩＢＣ邋ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｔｒａｉｎｉｎｇ邋ｓｅｔ邋（ａ）邋ａｎｄ逡逑ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｓｅｔ邋（ｃ）；邋ＲＯＣ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－１２４６邋ｆｏｒ邋ＭＩＢＣ邋ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｔｒａｉｎｉｎｇ邋ｓｅｔ逡逑（ｂ）邋ａｎｄ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｓｅｔ邋（ｄ）．逡逑

圖３．邐（ａ）邋ＲＯＣ曲線分析２－ｍｉＲＮＡｓ預測模型對肌層浸潤性膀胱癌的預測效（訓練組）；（ｂ）邋ＲＯＣ曲線分析２－ｍｉＲＮＡ預測模型對肌層浸潤性膀胱癌的預效能（驗證組）；（ｃ）病理分級對肌層浸潤性膀胱癌的預測效能；（ｄ）尿液脫細胞學對肌層浸潤性膀胱癌的預測效能。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．邋ＲＯＣ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｗｏ－ｍｉＲＮＡ邋ｐａｎｅｌ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｔｒａｉｎｉｎｇ邋ｓｅｔ邋（ａ），邋ｔｗｏ－ｍｉＲＮｐａｎｅｌ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｓｅｔ邋（ｂ），邋ｇｒａｄｅ邋（ｃ）邋ａｎｄ邋ｕｒｉｎａｒｙ邋ｃｙｔｏｌｏｇｙ邋（ｄ）邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｓｆｏｒ邋ＭＩＢＣ邋ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．逡逑

本文編號：2768600