【摘要】：目的:血管鈣化(vascular calcification,VC)是慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)的常見并發(fā)癥,在CKD各個階段均可發(fā)生,嚴重影響CKD患者的生命健康,然而其發(fā)生發(fā)展的具體機制仍未完全闡明,臨床防治措施有限。因此本研究通過腺嘌呤灌胃聯合高磷飼料喂養(yǎng)誘導CKD血管鈣化大鼠模型,觀察大鼠主動脈低氧誘導因子1α(hypoxia inducible factors 1alpha,HIF-1α)、血管內皮生長因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)及Notch1的表達,探討HIF-1α-VEGFA-Notch1信號通路在CKD血管鈣化中的作用,為探索CKD血管鈣化的具體機制及臨床防治措施提供新策略。方法:將60只SD大鼠隨機分為對照組(CON組,15只)、腺嘌呤灌胃組(CKD組,20只)、腺嘌呤灌胃聯合高磷飼料喂養(yǎng)組(CKD+HP組,25只)。CON組及CKD組予以普通大鼠飼料喂養(yǎng),CKD+HP組予以1.2%高磷飼料喂養(yǎng);CKD組及CKD+HP組將2.5%腺嘌呤混懸液以250mg/(kg·d)的劑量第1-4周每日灌胃1次,第5-8周隔日灌胃1次,CON組予以10ml/kg生理鹽水灌胃。在建模后第4、6與8周末,分別從各個組中隨機選取5只大鼠收集標本:收集24h尿液檢測尿蛋白定量;腹主動脈采血檢測尿素(Urea)、肌酐(Scr)、胱抑素(Cys C)、血鈣(Ca~(2+))和血磷(P~(3-));酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清HIF-1α水平;測量腎重/體重指數;蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察腎臟及血管病理改變;全組織Von kossa染色、茜素紅染色與主動脈鈣含量測定評估血管鈣化情況;免疫組化檢測大鼠主動脈α-SMA、Runx2、HIF-1α、VEGFA及Notch1蛋白表達;Real-time PCR檢測大鼠主動脈組織α-SMA、Runx2、HIF-1α、VEGFA和Notch1 mRNA表達。結果:1、大鼠體重、腎重及腎重/體重指數:與CON組相比,CKD及CKD+HP組大鼠體重各時間點均明顯降低(P0.001),腎重及腎重/體重指數均明顯升高(P0.001);與CKD組相比,CKD+HP組大鼠體重在第4周和第8周末更低(P0.01;P0.05),腎重在第6周末更高(P0.001),腎重/體重指數在第4周與第6周末更高(P0.05;P0.001)。2、血清學指標:(1)Urea、Scr與Cys C:與CON組相比,CKD及CKD+HP組大鼠各時間點Urea、Scr與Cys C明顯增加(P0.01);與CKD組相比,CKD+HP組大鼠各時間點Scr更高(P0.05),各時間點Urea及Cys C無明顯差異。(2)Ca~(2+)、P~(3-)與Ca~(2+)×P~(3-):與CON組相比,CKD+HP組大鼠第4周及第8周血Ca~(2+)降低(P0.05),CKD組及CKD+HP組大鼠各時間點血P~(3-)及Ca~(2+)×P~(3-)明顯升高(P0.01;P0.05);與CKD組相比,CKD+HP組大鼠第6周和第8周末血P~(3-)及Ca~(2+)×P~(3-)更高(P0.01,P0.05)。3、24h尿蛋白定量:CKD及CKD+HP組大鼠各時間點24h尿蛋白定量較CON組明顯增加(P0.01),而CKD組與CKD+HP組無明顯差異;CKD及CKD+HP組24h尿蛋白定量隨時間進展逐漸增多(P=0.009,P=0.003)。4、血清HIF-1α水平:CKD及CKD+HP組血清HIF-1α水平隨時間進展逐漸增多(P=0.009,P=0.033),在第8周末其水平較CON組明顯升高(P0.05),而兩組在各個時間點無明顯差異。5、腎臟病理改變:(1)肉眼:CON組:雙側腎臟大小正常,色暗紅,表面光滑,質軟,彈性好,切面皮髓質分界清晰;CKD與CKD+HP組:雙側腎臟體積增大,色灰白,呈“大白腎”改變,表面不光滑,質硬,彈性差。(2)HE染色:CON組腎小球、腎小管及腎間質結構及形態(tài)均正常;CKD及CKD+HP組自第4周末部分腎小球可見萎縮、囊腔輕度擴張,腎小管擴張、較多棕黃色物質沉積,腎間質纖維化,后隨時間進展病變逐漸加重,且CKD+HP組腎間質纖維化較CKD組出現早、程度重。6、主動脈病理改變:(1)肉眼:CON組各時間點大鼠主動脈形態(tài)正常,彈性好;CKD組第4周末大鼠形態(tài)尚光滑,彈性稍差,自第6周末大鼠主動脈逐漸出現彎曲、膨大,鈣化結節(jié),彈性差,血管脆性增加;CKD+HP組第4周末大鼠主動脈即彎曲、膨大明顯,表面不光滑,出現鈣化結節(jié),彈性極差,易脆,且隨時間進展鈣化結節(jié)逐漸增多。(2)HE染色:CON組各時間點大鼠主動脈形態(tài)結構正常;CKD組第4周末大鼠主動脈中膜彈性纖維排列紊亂,第6周末主動脈中膜呈節(jié)段性斷裂,彈性纖維減少,第8周末中膜呈連續(xù)線性斷裂,彈性纖維更少;CKD+HP組自第4周末大鼠主動脈即可見管壁增粗,中膜呈連續(xù)線性斷裂,彈性纖維明顯減少,并隨時間進展逐漸加重。7、主動脈鈣化情況:(1)全段血管Von kossa染色:CON組大鼠主動脈無黑色物質沉積;CKD組大鼠主動脈第6周末可見節(jié)段性黑色物質沉積,第8周末黑色物質沉積明顯增加;CKD+HP組第6周及第8周大鼠主動脈全段血管均可見黑色物質彌漫性沉積。(2)茜素紅染色:CON組各時間點大鼠主動脈未見橘紅色物質沉積;CKD組大鼠主動脈自第6周末可見節(jié)段性橘紅色物質沉積,第8周末橘紅色物質沉積明顯增加;CKD+HP組大鼠主動脈自第4周末可見橘紅色物質呈連續(xù)線狀沉積于主動脈中膜,并隨時間進展,橘紅色物質沉積逐漸增多。(3)大鼠主動脈鈣含量:CKD+HP組各時間點主動脈鈣含量均較CON及CKD組明顯增加(P0.001,P0.05),CKD組第6周與第8周主動脈鈣含量較CON組明顯增加(P0.001),且CKD+HP及CKD組主動脈鈣含量隨時間進展逐漸增加(P=0.002,P0.001)。8、主動脈蛋白表達:(1)α-SMA蛋白表達:與CON組相比,CKD組大鼠在第6周與第8周末及CKD+HP組大鼠各時間點主動脈α-SMA蛋白表達明顯降低(P0.01),且CKD組α-SMA的表達隨時間進展逐漸降低(P=0.001);與CKD組相比,CKD+HP組大鼠在第4周及第6周主動脈α-SMA蛋白表達更低(P0.05)。(2)Runx2蛋白表達:CKD+HP組大鼠各時間點主動脈Runx2蛋白表達較CON及CKD組均明顯升高(P0.001,P0.01),CKD組大鼠在第6周和第8周末主動脈Runx2蛋白表達較CON組明顯升高(P0.01),且CKD及CKD+HP組Runx2蛋白表達隨時間進展逐漸增加(P0.001,P=0.017)。(3)HIF-1α蛋白表達:CKD+HP組大鼠各時間點主動脈HIF-1α蛋白表達較CON及CKD組均明顯升高(P0.001,P0.05);CKD組大鼠在第6周與第8周末主動脈HIF-1α蛋白表達較CON組明顯升高(P0.01),且CKD組HIF-1α的表達隨著時間進展逐漸增加(P0.001)。(4)VEGFA蛋白表達:與CON組相比,CKD組大鼠第6周與8周時、CKD+HP組大鼠各時間點主動脈VEGFA蛋白表達均明顯增加(P0.05,P0.001);與CKD組相比,CKD+HP組大鼠第4周與8周末主動脈VEGFA蛋白表達更高(P0.05);CKD及CKD+HP組VEGFA的表達均隨時間進展逐漸增加(P=0.001,P=0.007)。(5)Notch1蛋白表達:與CON組相比,CKD組大鼠在第8周末、CKD+HP組大鼠各時間點主動脈Notch1蛋白表達明顯增加(P0.01,P0.001),且CKD組Notch1的表達隨時間進展而增加(P=0.001);與CKD組相比,CKD+HP組大鼠在第4周與6周末主動脈Notch1蛋白表達更高(P0.05)。9、主動脈mRNA表達:(1)α-SMA與Runx2 mRNA的表達:與CON組相比,CKD組大鼠在第8周末、CKD+HP組大鼠各時間點主動脈α-SMA mRNA表達明顯減低(P0.01,P0.05),與CKD組相比,CKD+HP組大鼠主動脈α-SMA mRNA表達在第4周末更低(P0.05),且CKD組α-SMA mRNA的表達隨時間進展逐漸降低(P=0.014);CKD+HP組大鼠主動脈各個時間點Runx2 mRNA表達較CON組及CKD組均明顯升高(P0.05),CKD組大鼠在第6周與第8周主動脈Runx2mRNA表達較CON組明顯升高(P0.05)。(2)HIF-1α、VEGFA與Notch1mRNA表達:與CON組相比,CKD組大鼠主動脈第8周末HIF-1α和Notch1 mRNA表達以及第6周與第8周末VEGFA mRNA的表達明顯增加(P0.05),CKD+HP組大鼠各時間點主動脈HIF-1α、VEGFA與Notch1mRNA表達明顯增加(P0.01,P0.05,P0.05),與CKD組相比,CKD+HP組大鼠主動脈HIF-1αmRNA表達在第4周及第6周末更高(P0.05),VEGFA mRNA表達在第4周及第8周末更高(P0.05,P0.01),Notch1表達在第4周末更高(P0.05),且CKD組HIF-1α和Notch1mRNA及CKD+HP組VEGFA mRNA的表達隨時間進展逐漸增(P=0.007,P=0.001,P0.001)。10、相關性分析:大鼠主動脈鈣含量與血清P~(3-)(r=0.618,P0.001)、Ca~(2+)×P~(3-)(r=0.590,P0.001)、血清HIF-1α(r=0.706,P0.001)、主動脈HIF-1α(r=0.852,P0.001)、VEGFA(r=0.747,P0.001)與Notch1(r=0.813,P0.001)蛋白表達呈正相關,與血清鈣無顯著相關性(r=-0.246,P=0.104);血清磷與血Urea、Scr、Cys C及24h-UPro明顯相關(r=0.559,P0.001;r=0.676,P0.001;r=0.537,P0.001;r=0.539,P0.001);主動脈VEGFA蛋白表達與主動脈HIF-1α(r=0.738,P0.001)蛋白表達明顯相關;主動脈Notch1蛋白表達與主動脈HIF-1α和VEGFA蛋白表達明顯相關(r=0.865,P0.001;r=0.699,P0.001)。結論:1、腺嘌呤灌胃聯合高磷飼料喂養(yǎng)大鼠,較單獨腺嘌呤灌胃能夠更加快速、穩(wěn)定地建立慢性腎臟病血管鈣化動物模型;2、高磷血癥促進慢性腎臟病血管鈣化及腎臟病進展;3、慢性腎臟病大鼠主動脈鈣化時存在HIF-1α-VEGFANotch1信號通路激活,表明HIF-1α-VEGFA-Notch1信號通路可能參與了CKD血管鈣化的發(fā)生發(fā)展;4、慢性腎臟病血管鈣化大鼠血清HIF-1α水平明顯升高,且與主動脈鈣化嚴重程度成顯著正相關,有望成為評估CKD血管鈣化嚴重程度的血清學標志物之一。
【學位授予單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R692
【圖文】：

大小便正常，體重逐漸增加。CKD 組：灌胃后第 3 周起，大鼠精神狀態(tài)欠佳，攝食量減少，飲水量增加，反應稍遲鈍，活動度減少，毛發(fā)黯淡、豎毛，大便正常，小便增多，體重減輕。第 4 至 5 周時大鼠精神狀態(tài)差，攝食量明顯減少，陰毛濕潤，并出現死亡。第 6 周后進食稍增加，體重基本穩(wěn)定，未再出現死亡。CKD+HP 組：灌胃后第 2 周起，大鼠精神狀態(tài)不佳，攝食量減少，飲水量增加，反應稍遲鈍，活動度減少，毛發(fā)黯黃散亂（如圖 1.1），體重減輕，外陰毛發(fā)濕潤，尾巴濕冷，大便正常，小便增多。第 3 周起攝食量及體重明顯減少，并開始出現死亡。第 4 至 5 周時大鼠精神萎靡，反應遲鈍、目光呆滯，畏寒拱背，毛發(fā)黯黃、干枯脫落，小便量及死亡率明顯增多。第 6 周后，大鼠進食、體重下降及死亡率較前逐漸改善。

西 南 醫(yī) 科 大 學 碩 士 學 位 論 文CKD+HP 組：第 4 周末腎小管顯著擴張，管腔斷裂，無正常腎小管結構存在；腎間質炎性細胞浸潤，增生纖維化明顯；其余病理改變同CKD 組。第 6 周及 8 周末與 CKD 組相比，CKD+HP 組腎臟結構紊亂、腎間質纖維化更嚴重（見圖 3.2）。

西 南 醫(yī) 科 大 學 碩 士 學 位 論 文大明顯，出現節(jié)斷性鈣化結節(jié)，部分出現動脈瘤樣改變，彈性較差，血管脆性增加。CKD+HP 組：第 4 周末大鼠主動脈彎曲、膨大明顯，表面不光滑，多數大鼠形成鈣化結節(jié)，第 6 周及 8 周末大鼠主動脈鈣化結節(jié)更多，彈性極差，易脆。4.2 顯微鏡下病理改變CON 組：各時間點大鼠主動脈可見內膜、中膜、外膜三層完整的結構，管壁厚度正常，內皮光滑，中膜可見呈波浪狀排列、規(guī)則連續(xù)的彈性纖維。見圖 4.2。

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本文編號：2760399