【摘要】：目的急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是一種具有高發(fā)病率和高病死率的臨床綜合征,但現(xiàn)有方法療效不佳。應(yīng)用間質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)AKI已有廣泛報(bào)道,但其治療效率仍需進(jìn)一步提高。本文旨在研究小分子藥物白藜蘆醇(resveratrol,RES)預(yù)處理對(duì)人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,huc MSC)治療AKI療效的增強(qiáng)作用,并探討其相關(guān)機(jī)制。方法細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和MTT法確定RES預(yù)處理huc MSC的濃度和時(shí)間。構(gòu)建順鉑誘導(dǎo)的AKI大鼠模型,經(jīng)尾靜脈分別注射DMSO或RES預(yù)處理的huc MSC(DMSO-或RES-huc MSC)。通過(guò)血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平,腎組織切片HE染色、腎小管損傷評(píng)分、Western blot、免疫組化和TUNEL實(shí)驗(yàn)比較RES處理前后huc MSC對(duì)AKI治療效果的差異。體外細(xì)胞模型采用大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E,經(jīng)順鉑處理后與DMSO-或RES-huc MSC共培養(yǎng),流式細(xì)胞術(shù)、Western blot、免疫組化和TUNEL實(shí)驗(yàn)觀察NRK-52E細(xì)胞的凋亡情況。在機(jī)制研究方面,采用Western blot和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RES對(duì)huc MSC生物學(xué)功能的影響。QRT-PCR篩選RES作用后huc MSC中變化最明顯的因子(PDGF-DD),Western blot檢測(cè)PDGF-DD下游ERK通路的活化情況。利用si RNA敲減PDGF-DD以證實(shí)其在RES改造huc MSC中的作用。同時(shí),在AKI大鼠模型中進(jìn)一步研究PDGF-DD在RES-huc MSC發(fā)揮腎保護(hù)功能中的作用。此外,我們收集DMSO-和RES-huc MSC的培養(yǎng)上清(Cd M),觀察不同Cd M對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC增殖和遷移能力的影響。并采用免疫熒光檢測(cè)大鼠腎組織中CD31的水平。通過(guò)si RNA敲減實(shí)驗(yàn)探討PDGF-DD在RES-huc MSC促血管生成中的作用。結(jié)果細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和MTT法確定RES處理huc MSC的濃度和時(shí)間分別為20mmol/L,12h。RES預(yù)處理增強(qiáng)huc MSC對(duì)順鉑誘導(dǎo)的AKI的修復(fù)作用,表現(xiàn)為血清Cr、BUN水平降低,腎小管結(jié)構(gòu)保存完整,腎小管損傷評(píng)分低,管型沉積少,腎小管上皮細(xì)胞凋亡明顯改善。順鉑損傷細(xì)胞模型結(jié)果進(jìn)一步佐證上述結(jié)論。與huc MSC相比,RES-huc MC能更好地抑制順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞凋亡。在機(jī)制方面,其一,RES促進(jìn)huc MSC自分泌PDGF-DD,活化下游ERK通路,抑制huc MSC凋亡,促進(jìn)huc MSC增殖。反之,敲減PDGF-DD抑制RES-huc MSC的ERK通路,削弱RES對(duì)huc MSC的抗凋亡和促增殖作用。其二,RES促進(jìn)huc MSC旁分泌PDGF-DD,上調(diào)RES-huc MSC組大鼠腎組織中PDGF-DD和PDGFR-b的水平,活化了腎小管上皮細(xì)胞ERK通路,抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡。而敲減PDGF-DD后,RES-huc MSC組腎小管上皮細(xì)胞ERK通路受抑制,腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加,RES-huc MSC對(duì)AKI大鼠的修復(fù)作用減弱。其三,與DMSO-huc MSC的Cd M相比,RES-huc MSC的Cd M促進(jìn)HUVEC增殖和遷移,且RES-huc MSC組大鼠腎組織中CD31的表達(dá)較DMSO-huc MSC組顯著上調(diào)。但敲減PDGF-DD后,RES-huc MSC的Cd M對(duì)HUVEC的遷移和增殖作用減弱,且大鼠腎組織中CD31的水平降低。結(jié)論RES通過(guò)促進(jìn)huc MSC分泌PDGF-DD,活化腎小管上皮細(xì)胞ERK通路,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成,從而提高了huc MSC在AKI中的修復(fù)效率,為增強(qiáng)干細(xì)胞療效提供了新策略。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R692
【圖文】：

白藜蘆醇預(yù)處理的間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)急性腎損傷的保護(hù)及機(jī)制研究共培養(yǎng) 36h）、RES-hucMSC（NRK-52E 經(jīng)順鉑處理 12h 后與 RES-hucMSC 共培養(yǎng) 36h）。流式細(xì)胞術(shù)、Western blot、免疫組化和 TUNEL 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) NRK-52E 細(xì)胞的凋亡情況。見(jiàn)技術(shù)路線 1。

圖 2.2 技術(shù)路線 2：小分子藥物 RES 對(duì) hucMSC 的作用研究2.2.4 RES 改造 hucMSC 的相關(guān)機(jī)制從干性和旁分泌兩個(gè)角度考慮，qRT-PCR 篩選出 RES 作用前后 hucMSC 中變化最明顯的分子 PDGF-DD。經(jīng)小干擾 RNA（siRNA）敲減hucMSC 中PDGF-DD后，從 hucMSC 增殖、凋亡和促血管生成方面重新評(píng)價(jià) RES 對(duì) hucMSC 的體外作用。見(jiàn)技術(shù)路線 3。

圖 2.3 技術(shù)路線 3：RES 改造 hucMSC 的相關(guān)機(jī)制S 預(yù)處理的 hucMSC 修復(fù) AKI 的機(jī)制研究）比較有無(wú) RES 修飾的 hucMSC 對(duì) AKI 大鼠腎組織中 PDGF-D信號(hào)通路的表達(dá)水平。）在 RES-hucMSC 中轉(zhuǎn)染 siRNA 對(duì) PDGF-DD 進(jìn)行敲減，構(gòu)尾靜脈注射有無(wú)轉(zhuǎn)染 siRNA 的 RES-hucMSC，評(píng)價(jià)修復(fù)效果見(jiàn)技術(shù)路線 4。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Aida Zulueta;Anna Caretti;Paola Signorelli;Riccardo Ghidoni;;Resveratrol: A potential challenger against gastric cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2015年37期

本文編號(hào)：2758476