【摘要】：目的:膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率有逐漸上升的趨勢,是嚴重威脅人們健康的常見病。目前膀胱癌的分子生物學機制還不完全清楚,因此,闡明其機制,有助于探尋疾病根源,及早作出診斷,針對性采取有效措施,提高治療效果,對于臨床膀胱癌的控制具有重要意義。沉默信息調節(jié)因子(silence information regulator,Sirtuin)在細胞周期控制、維持線粒體的動態(tài)平衡、自噬和細胞生長調節(jié)等過程中發(fā)揮重要作用。SIRT3是其中重要的一員,同樣可以發(fā)揮上述作用,它主要存在于線粒體當中,學者們在細胞核中也發(fā)現(xiàn)了上述因子,但含量相對較少。它可調控多種線粒體蛋白的乙酰化修飾,從而影響細胞內的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平和能量代謝水平。SIRT3對于能量調節(jié)至關重要,這一點也獲得了廣泛共識,如果缺乏上述因子,將會對線粒體產(chǎn)生影響,導致過度乙�；�,進而影響功能,引發(fā)能量代謝異常,甚至會影響有絲分裂。SIRT3通過調節(jié)ROS,抑制缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)的轉錄活性,抵抗氧化應激,達到抑制腫瘤生長的作用。上皮間質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是上皮細胞向間質細胞的轉換,在此過程中獲取了移行能力,因而具有侵襲性。E-cadherin是EMT的關鍵分子,用于維持正常細胞間緊密連接的穩(wěn)定性,其表達水平與EMT的發(fā)生及腫瘤的侵襲能力負相關,轉錄因子如鋅指蛋白Snail,SIP-1,Slug,Twist等可下調E-cadherin表達進而促進EMT發(fā)生。Snail和Twist是腫瘤發(fā)生EMT的主要誘導因子,對于誘導腫瘤EMT、侵襲和轉移具有獨立或協(xié)同作用。研究表明,晚期膀胱癌的高侵襲性與EMT關系密切。而且,腫瘤中HIF-1α的增多表達可通過EMT使腫瘤的侵襲性增強。推測在膀胱癌中,SIRT3的表達可能通過調節(jié)HIF-1α進而影響EMT相關因子的表達來調控其生長、侵襲等生物學行為。本課題通過沉默和過表達膀胱癌T24細胞系中SIRT3的表達,利用體外實驗,探討SIRT3在膀胱癌上皮間質轉化中的作用,為尋找膀胱癌治療的新靶點提供一定的理論依據(jù)。研究方法:1、腫瘤細胞的培養(yǎng):膀胱癌T24細胞株,生長在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,與37℃、5%CO_2飽和濕度條件下進行培養(yǎng)。2、免疫組織化學分析:收集中國醫(yī)科大學附屬一院泌尿科膀胱癌患者的病理標本,進行HE染色和組織化學染色,分析膀胱癌組織和癌旁組織中SIRT3、HIF-1α、E-cadherin、Snail、Slug和Vimentin的表達水平。并分析SIRT3蛋白表達水平與臨床病例資料及其病理學特征之間的關系。3、質粒的構建及細胞轉染:設計干擾靶點,慢病毒轉染T24細胞,并用RT-PCR和Western blot檢測轉染細胞中沉默和過表達SIRT3基因的效率。4、Transwell小室和劃痕實驗主要應用于細胞能力檢測,在細胞轉染前后進行,可確定其侵襲、遷移能力是否發(fā)生了改變。Transwell侵襲實驗中,下室加入500μl含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,將200μl單細胞懸液加入到上室,細胞數(shù)量為1×10~5/孔,培養(yǎng)24小時候觀察并計數(shù)侵襲至膠膜下的細胞數(shù)量。劃痕實驗中,準備6孔板,選擇2×10~5個膀胱癌細胞,要求生長良好,將其接種于孔板之上,觀察融合度變化,當達到90%時,用200μl的移液器槍頭在6孔板的內部底面上沿直線劃痕,劃痕后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24h,置于倒置顯微鏡下,觀察和測量單層細胞劃痕的愈合情況。5、蛋白提取及Western blot檢測:提取膀胱癌細胞總蛋白,對其進行檢測,確定濃度大小。Western blot實驗以內參抗體GAPDH,及MMP-2、MMP-9、HIF-1α、Snail、Slug、E-cadherin、Vimentin和Twist為一抗,分析其蛋白的表達。凝膠圖像處理,對灰度進行分析。6、統(tǒng)計學分析:經(jīng)三次重復實驗,獲取相關數(shù)據(jù),均值±標準差表示。組間比較t檢驗。Pearson分析SIRT3與腫瘤分期及病理類型等的相關性。SPSS17.0及Graphpad Prism5.0分析及繪圖,P0.05有統(tǒng)計學差異。結果:1、SIRT3在膀胱癌組織中的表達及臨床意義:免疫組化結果顯示,SIRT3和E-cadherin在膀胱癌組織中的表達率明顯低于癌旁組織;HIF-1α、Snail、Slug和Vimentin的水平,膀胱癌組織明顯高于癌旁組織。相關性分析結果顯示,T3N0M0組中SIRT3的表達水平明顯低于TaN0M0組(P0.05);高分化膀胱癌組織中SIRT3的表達水平明顯高于低分化組(P0.05);淋巴結轉移的膀胱癌患者組織中SIRT3的水平也明顯降低,與未發(fā)生淋巴結轉移的患者組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2、沉默SIRT3基因對膀胱癌細胞侵襲轉移及上皮間質轉化的影響:RT-PCR和Western blot實驗檢測慢病毒干擾SIRT3基因的效率,pLK0.1-shRNA-SIRT3組膀胱癌T24細胞中SIRT3的表達明顯低于NC組和Control組(P0.05)。說明慢病毒沉默SIRT3基因成功。Transwell實驗結果顯示,pLK0.1-shRNA-SIRT3組細胞穿過基質膠的細胞數(shù),與NC和Control組細胞相比增多,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。劃痕實驗結果,與pLK0.1-NC和Control組細胞相比,pLK0.1-shRNA-SIRT3組細胞的遷移能力增強,具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Western blot法檢測結果顯示,MMP-2、MMP-9、HIF-1α、vimentin、twist、snail和slug的表達,均是pLK0.1-shRNA-SIRT3組細胞的表達水平高于NC和Control組,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);E-cadherin的表達水平,pLK0.1-shRNA-SIRT3細胞組低于NC和Control細胞組中的表達,差異也無統(tǒng)計學意義(P0.05)。3、過表達SIRT3基因對膀胱癌細胞侵襲轉移及上皮間質轉化的影響:RT-PCR和Western blot實驗檢測質粒轉染SIRT3基因的效率,pCDH-promoter-SIRT3組膀胱癌T24細胞中SIRT3的表達明顯高于NC組和Control組(P0.05)。說明構建過表達SIRT3基因的細胞系成功。Transwell實驗結果顯示,pCDH-promoter-SIRT3組細胞穿過基質數(shù)量減少,與對照組相比,統(tǒng)計學差異顯著(P0.01)。劃痕實驗結果,與NC和Control組細胞相比,過表達pCDH-promoter-SIRT3組細胞的遷移能力減弱,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Western blot法檢測結果顯示,MMP-2、MMP-9、HIF-1α、vimentin、twist、snail和slug的表達,均是pCDH-promoter-SIRT3組細胞的表達水平明顯低于NC和Control組,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);E-cadherin的表達水平,pCDH-promoter-SIRT3細胞組明顯高于NC和Control細胞組中的表達,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1、SIRT3在膀胱癌組織及癌旁組織中的表達存在差異;SITR3的表達水平與膀胱癌的組織分化程度、臨床分期存在相關性;SIRT3的表達水平與膀胱癌的淋巴結轉移顯著相關。2、慢病毒載體可以有效提高shRNA的轉染效率;慢病毒shRNA有效干擾了膀胱癌T24細胞系中SIRT3的表達,成功構建沉默和過表達SIRT3基因的膀胱癌細胞系。3、相關功能實驗結果提示,與對照組相比,沉默SIRT3基因組膀胱癌細胞的遷移和侵襲能力增強;過表達SIRT3基因組膀胱癌細胞的遷移和侵襲能力明顯減弱。沉默SIRT3的表達可以促進膀胱癌細胞中與EMT相關因子的表達;過表達SIRT3基因可以抑制與EMT相關因子的表達。揭示SIRT3基因的表達在膀胱癌細胞的侵襲轉移及上皮間質轉化中發(fā)揮重要作用。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.14
【圖文】：

性 11 1例數(shù) 30 30百分比 63.33%*96.67%評分 2.31±1.20*8.72±3.35與癌旁組織相比，P<0.05。白在癌組織中表達癌組織進行免疫組化測定，結果顯示 SIRT3 蛋表達（圖 1），主要分布于細胞漿之中。白在癌旁組織中表達癌旁組織進行免疫組化測定，結果顯示 SIRT3細胞漿，見圖 1。

中國醫(yī)科大學博士學位論文胱癌組織中相關因子的表達組化結果顯示，膀胱癌組織中 HIF-1α呈高表達，癌旁組織中異顯著（P<0.05）；E-cadherin 在癌旁組織中表達增高，在癌組織統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Snail 的表達在癌組織中呈高表達，癌差異顯著（P<0.05）；膀胱癌組織中 slug 的表達水平高，癌旁差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Vimentin 的表達水平，在癌組，癌旁組織中低表達，且差異顯著（P<0.05）。見圖 2。

中國醫(yī)科大學博士學位論文3.1.5 膀胱癌患者 SIRT3 表達與病理、臨床及淋巴結轉移的關系對所獲取的癌旁組織進行免疫組化測定，通過 Image J 軟件分析，得SIRT3 等因子相對定量值，再結合臨床資料進行相關性分析。根據(jù)臨床分期進行分組，統(tǒng)計結果顯示，T3N0M0 組中 SIRT3 的表達水平顯低于 TaN0M0 組（P<0.05），與其他兩組（T1N0M0、T2N0M0）相比，差異有統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖 3）。

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